Dans cette vidéo, nous fournissons un guide étape par étape pour recueillir les chauves-souris d’une manière humaine, afin de minimiser l’impact sur les populations et de maximiser la valeur scientifique. Les avantages de notre approche sont que nous maximisons la quantité de données moléculaires et morphologiques potentielles pour chaque chauve-souris, préservons les tissus pour conserver leur valeur future et minimisons la récolte des individus sauvages. Les protocoles de dissection sont difficiles à démontrer verbalement.
Bon nombre des techniques de préparation des tissus que nous présentons ici sont mieux communiquées en visualisant comment différents organes sont identifiés, puis correctement disséqués et stockés. Préparez tous les flacons avant de commencer les dissections pour éviter les retards. Pour l’ARN, mettre de côté le nombre de flacons nécessaires pour chaque spécimen.
Étiquetez chaque tube avec le type de tissu qui sera recueilli, ainsi que les informations standard d’identification des spécimens. Remplissez les flacons 50% plein de solution stabilisatrice d’ARN, et refroidissez à quatre degrés Celsius. Prenez soin de ne pas remplir complètement les flacons avec une solution stabilisatrice de l’ARN, car le tube peut exploser lors de sa mise dans de l’azote liquide.
Immédiatement après l’euthanasie, effectuer la décapitation du spécimen de chauve-souris tel que décrit dans le protocole de texte. Écorché le crâne des muscles des cheveux, des fascias et du crâne, y compris la peau du nez. Prenez soin de ne pas casser l’extrémité avant du nez.
Retirez les yeux avec des forceps, en utilisant une force assez forte pour détacher le nerf optique. Placez les yeux dans un flacon de deux millilitres de solution stabilisatrice arn. Utilisez des ciseaux pour faire une coupe sagittale sur la partie dorsale du crâne à partir du cou, en prenant soin de ne pas endommager le cerveau.
Ensuite, utilisez des forceps pour tirer doucement en arrière des deux côtés du crâne, jusqu’à ce qu’il soit fissuré ouvert pour exposer le cerveau. Assurez-vous que le crâne de l’extrémité crânienne a été enlevé, de sorte que les forceps peuvent facilement gratter le cerveau. Grattez doucement le cerveau avec des forceps.
Le cerveau sera très doux. L’ampoule olfactive deviendra visible, assise à la partie ventrale de l’intérieur du crâne. Essayez de garder l’ampoule olfactive attachée.
Si possible, gardez la forme du cerveau intacte, et placez-la immédiatement sur la glace sèche, ou dans un flacon de cinq millilitres de solution stabilisatrice de l’ARN. Sur l’extrémité caudale du crâne, le cochléi doit maintenant être visible latéralement de chaque côté de la tête. Utilisez des forceps pour tirer doucement le cochléi.
Ensuite, mettez-les dans un flacon de deux millilitres de solution stabilisatrice arn. Faire deux incisions où la mâchoire supérieure et inférieure se rejoignent, et enlever la mandibule. La plaque cribriform deviendra apparente.
Il s’agit d’un os essentiel pour garder le chercheur orienté. Il peut être identifié comme la région la plus antérieure du crâne, avec de multiples contre-hommes, et avec deux rainures où repose l’ampoule olfactive. Une fois que la mandibule a été enlevée, retirez la tribune de la partie restante du crâne.
Assurez-vous que la mâchoire comprend la plaque cribriforme. Placez le nez dans la solution stabilisatrice de l’ARN et rangez-le à quatre degrés Celsius pendant la nuit. De la mandibule inférieure, couper la langue avec des ciseaux, et placer dans un flacon de deux millilitres de solution stabilisatrice arn.
Placer le flacon nasal dans de l’azote liquide après le trempage pendant la nuit dans la solution stabilisatrice de l’ARN. Après 24 heures de trempage sur la glace ou au réfrigérateur, placer les échantillons dans de l’azote liquide. Utilisez un scalpel pour percer la cavité abdominale, en faisant une incision longitudinale jusqu’aux côtes.
Cela perd le cadre squelettique. Dépouiller la peau pour révéler le muscle pectoral, et prendre au moins deux échantillons de muscle. Des tissus pour l’ARN et l’ADN sont rassemblés pendant ces dissections.
Placez les tissus pour l’ADN de poids moléculaire élevé dans les cryovials secs, et congèlez flash dans l’azote liquide. Placez les tissus pour l’ARN dans la solution stabilisatrice de l’ARN. Couper à travers le sternum, et retirer les côtes.
Maintenant, récupérez le poumon et le cœur. Utilisez le scalpel et les forceps pour séparer le cœur du poumon. Utilisez un scalpel pour briser le poumon, et placer dans la solution stabilisatrice de l’ARN.
Recueillir le cœur, qui peut être pris entier, mais doit être sectionné en deux, de sorte que la solution stabilisatrice de l’ARN trempage à fond. Maintenant, prélevez des échantillons du foie. Prélevez au moins deux échantillons de foie.
Placez un échantillon dans un flacon pour rester congelé pour obtenir de l’ADN de poids moléculaire élevé et placez l’autre échantillon dans la solution stabilisatrice de l’ARN. Suivez le conduit hépatique pour trouver le pancréas et la vésicule biliaire. Transférer la vésicule biliaire dans un flacon de solution stabilisatrice de l’ARN.
Trouvez l’estomac, et la rate en forme de plumes à sa base, apparaissant comme une nuance différente de pourpre. Le pancréas doit également être visible ici comme une structure de poids. Recueillir l’estomac, la rate et le pancréas, dans les flacons respectifs de solution stabilisatrice de l’ARN.
Prélever de petits échantillons de l’intestin grêle et gros. Placer dans des flacons respectifs de solution stabilisatrice d’ARN. Prenez l’un des reins, et suivez leurs conduits à la vessie, puis placez-les dans les flacons respectifs de solution stabilisatrice de l’ARN.
Utilisez l’autre rein comme guide pour trouver les testicules si mâle, ou utérus et ovaires si femelle. Recueillir une ou les deux 9es si possible. Prélevez également des échantillons de différentes parties de la peau de l’aile et conservez-les dans des flacons séparés.
Le principal avantage de notre approche est qu’elle nous permet d’échantillonner les animaux d’une manière non létale, tout en générant suffisamment de matériel pour les études génomiques, ainsi que les études moléculaires fonctionnelles. Notre protocole permet la préparation de fibroblastes primaires à partir du tissu des ailes. Les cellules représentent une précieuse source renouvelable de matériel génétique, ainsi qu’un modèle pour les explorations fonctionnelles et moléculaires chez les chauves-souris.
Les clips d’aile qui ont été conservés dans les supports de croissance selon la section six du protocole écrit devraient être transférés à l’installation de culture tissulaire. Transférer le contenu du tube dans un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres. La biopsie de membrane d’aile est employée pour cette démonstration.
Retirez soigneusement le milieu de croissance. Lavez doucement la biopsie deux fois avec 500 microlitres de PBS stérile. Ajouter 500 microlitres d’un milligramme par collagène millilitre quatre au tube.
Cela provoquera la digestion du tissu en cellules individuelles. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius sans agitation. Le deuxième jour, faire un milieu de croissance frais, et l’avant-guerre à 37 degrés Celsius.
Préparer une plaque de culture des tissus de six puits en ajoutant deux millilitres de milieu de croissance frais préchauffé dans chaque puits de la plaque à utiliser. Conservez cette plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que nécessaire. Retirez le tube de 15 millilitres contenant les cellules de l’incubateur et étanchez la réaction de digestion en ajoutant un millilitre de milieu de croissance frais.
Resuspendez les cellules en triturant soigneusement la solution avec une pointe de pipette P1000 pour obtenir une suspension à cellule unique. Faites tourner doucement les cellules dans une centrifugeuse de table pendant trois minutes à 300 fois G.Jetez le supernatant en enlevant doucement 80 à 90% du liquide avec une pipette P1000. Resuspendez la pastille dans 500 microlitres de milieu de croissance préchauré.
Triturer délicatement la suspension pour s’assurer que la pastille n’est plus visible et que les cellules sont suffisamment suspendues, en s’assurant d’éviter les petits morceaux de tissu qui peuvent encore être visibles sur les murs. Pipette doucement tout le volume de suspension cellulaire dans un seul puits de la plaque de six puits qui a été préparé plus tôt, contenant le média de croissance d’avant-guerre. Secouez doucement la plaque d’un côté à l’autre et de l’avant à l’arrière deux à trois fois pour aider les cellules à se répartir sur la surface du puits en une seule couche.
Vérifiez les cellules plaquées au microscope. Il devrait s’agir de cellules simples qui semblent enseillées et flottantes, mais très denses. Placez soigneusement la plaque dans un incubateur prédéfinit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Après environ 24 heures, observez les cellules au microscope pour déterminer la santé de la culture. Les cellules doivent maintenant être fixées à la surface de la plaque et semblent aplaties. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié prédéfinit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Les cellules doivent être observées régulièrement au microscope pour déterminer la nécessité d’un rafraîchissement ou d’un fractionnement des médias. Chaque fois que nécessaire, aspirez soigneusement environ 50% du milieu du puits, et ajoutez doucement un millilitre de milieu de croissance préchauré sur le côté du puits, afin de ne pas déranger les cellules. Lorsqu’il est nécessaire de passer les cellules, aspirez soigneusement environ 90% du milieu de croissance.
Lavez les cellules très doucement en ajoutant un millilitre de PBS stérile à la paroi du puits, afin de ne pas déranger les cellules. Bercer délicatement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre deux à trois fois. Aspirez soigneusement tous les PBS de la plaque avant de laver à nouveau les cellules.
Ajouter la trypsine EDTA au puits, et bercer doucement la plaque pour couvrir toute la surface du puits avec de la trypsine EDTA, et incuber pendant une minute et demie à température ambiante. Étancher la réaction en ajoutant un millilitre de milieu de croissance frais préchauré. Pipette de haut en bas environ cinq fois pour laver les cellules de la surface de la plaque, et s’assurer que les cellules sont en suspension.
Placez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres, et faites tourner les cellules dans une centrifugeuse de table pendant trois minutes à 300 fois G.Jetez le supernatant en enlevant doucement 80 à 90 pour cent du liquide avec une pipette P1000. Resuspendez la pastille en un millilitre de milieu de croissance préchauré et triturez doucement la suspension. Assurez-vous que la pastille ou les gros fragments de la pastille ne sont plus visibles et que les cellules sont en une seule suspension cellulaire.
Pour compter la cellule à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé, mélanger un aliquot de dix microlitres des cellules suspendues un à un avec du bleu trypan pour détecter les cellules viables. Incuber pendant une minute, et pipette 10 microlitres de la solution sur la diapositive de comptage. Insérez la diapositive de comptage dans un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules à l’aide des paramètres appropriés.
Préparez les supports de congélation en combinant le milieu de croissance avec le DMSO pour obtenir une concentration finale de 10% DMSO. La pastille doit être préparée à partir d’un puits de 80 à 90 % confluent d’une plaque de six puits. Resuspendez la pastille en un millilitre et demi de milieu de congélation.
Placez environ 750 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des deux cryoviaux distincts. Placez les flacons dans un récipient cryogénique de congélation, de sorte que les cellules gèlent lentement pour maintenir la vitalité cellulaire. Placez-les immédiatement à moins 80 degrés Celsius.
Pour décongeler les cellules gelées, préparer une plaque de six puits contenant deux millilitres de milieu de croissance préchauffé dans chaque puits qui sera utilisé. Maintenir la plaque dans l’incubateur de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que nécessaire. Prenez un flacon de cellules de l’azote liquide, et placez-le dans un bain d’eau chaude pour décongeler rapidement les cellules.
Cela devrait prendre de deux à trois minutes. Dès que la solution dans le flacon a décongelé, pipette doucement de haut en bas pour homogénéiser la solution, et placez immédiatement la solution entière dans un puits de la plaque de six puits. Secouez doucement la plaque d’un côté à l’autre et de l’avant à l’arrière deux à trois fois pour aider les cellules à se répartir sur la surface du puits en une seule couche.
Placez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures. Surveiller et passer les cellules comme démontré. Les résultats représentatifs des extractions d’ADN sont montrés pour les analyses d’ADN standard de trois espèces de chauves-souris.
Une seule grande bande indique une fragmentation minimale et des fragments d’ADN de taille similaire provenant de chaque extraction respective. Un indicateur commun de succès pour les extractions d’ARN est le nombre d’intégrité d’ARN, ou RIN, avec des valeurs au-dessus de huit représentant la qualité élevée dans l’ARN de tact. On y voit les valeurs RIN des extractions d’ARN de 13 types de tissus différents d’espèces néotropicales de chauves-souris, échantillonnées dans quatre localités différentes.
Les tissus prélevés sur des espèces des Andes, du Costa Rica et de la République dominicaine ont été placés directement dans de l’azote liquide après avoir trempé dans la solution stabilisatrice de l’ARN à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Les tissus échantillonnés à partir d’espèces en Amazonie ont été placés dans de l’azote liquide environ une semaine après avoir placé une solution stabilisatrice de l’ARN, et maintenus à quatre degrés Celsius en continu. Même dans de tels cas, les valeurs rin étaient comparables à celles immédiatement placées dans la solution stabilisatrice d’ARN, et directement dans l’azote liquide.
Après la culture tissulaire, les cultures cellulaires des chauves-souris devraient couvrir 80 à 90 % de la surface de la plaque et maintenir leur morphologie originale. Il s’agit de l’étape optimale pour la division. Après plus de six passages, les cellules changeront leur morphologie pour devenir plus grandes et plus longues, et les cellules entreront dans la sénescence.
Les cellules brillantes en boule représentent les cellules mortes. Les cellules en culture représentent une source renouvelable de matériaux, comme l’ADN, l’ARN et les protéines. Ces lignées cellulaires peuvent être gelées, fournissant ainsi une ressource qui peut être utilisée au cours de nombreuses années de recherche.
Cela permet des études génomiques, transcriptomiques et fonctionnelles qui seront difficiles à utiliser à l’aide de tissus primaires. Par exemple, les cellules peuvent être modifiées génétiquement ou chimiquement pour observer les effets sur les phénotypes cellulaires.
