Cette méthode est significative parce qu’elle peut être utilisée pour obtenir de grandes quantités d’ostéoclastes entièrement différenciés in vitro. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est plus stable et sûre et isole la moelle osseuse en moins de temps et avec moins d’efforts par rapport à la procédure traditionnelle. Cette technique peut fournir une source stable d’ostéoclastes, qui sont l’objet important de la maladie métabolique osseuse, y compris l’ostéoporose, la parodontite et l’ostéolyse périprothétique.
Avec des modifications mineures, ce protocole peut également être approprié pour obtenir divers types de moelle osseuse dérivée des cellules chez les rats ou d’autres animaux. Pour commencer, placez les animaux euthanasiés sur une planche désinfectée dans une position de supination. À l’aide de ciseaux stériles, faire une incision d’environ un centimètre de longueur au fémur proximal pour peler la peau.
Ensuite, disséquez les fémurs et les tibias. Coupez soigneusement et doucement les parties bilatérales de la connexion autour des articulations de la hanche, du genou et de la cheville pour isoler les tibias et les fémurs. Couper une partie des tissus autour de l’os, en s’assurant d’être complet.
Ensuite, placez les os nettoyés dans un plat avec cinq millilitres de milieu de culture complet. Utilisez des ciseaux stériles pour couper l’os long. Utilisez une aiguille de seringue d’un millilitre pour rincer soigneusement la cavité de la moelle avec 10 millilitres de médias complets jusqu’à ce que la cavité de la moelle soit blanchie.
Transférez cette suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres et filtrez-la à l’aide d’une passoire de 70 micromètres pour enlever le tissu restant. Ajouter cinq millilitres de tampon de lyse de sang rouge et incuber les cellules sur la glace pendant huit minutes. Après cela, centrifuger les cellules à 250 fois G pendant cinq minutes pour donner la pastille cellulaire.
Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en 10 millilitres de médias complets. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et calculez le temps consacré aux actions prises pour cette méthode. Tout d’abord, placer les animaux euthanasiés sur une planche désinfectée dans une position supine.
À l’aide de ciseaux stériles, faire une incision d’environ un centimètre de longueur au fémur proximal pour peler la peau. Ensuite, disséquez les fémurs et les tibias. Couper les parties des tissus autour de l’os, mais il n’est pas nécessaire d’enlever le tissu complètement.
Rincer les tibias et les fémurs avec 12 millilitres de PBS, puis les couper en deux. Placez les tibias et les fémurs coupés en deux dans une pointe de pipette préparée d’un millilitre, et placez-la dans un tube de micro centrifugeuse préparé. Centrifugeuse le tube trois fois à 1000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 45 secondes.
Après cela, retirez la pointe pipette contenant l’os du tube, en laissant la moelle osseuse dans le tube. Ajouter 200 microlitres de PBS au tube, et pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour désintégrer la moelle à fond. Transférez cette suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres et filtrez-la à l’aide d’une passoire de 70 micromètres pour enlever les tissus restants.
Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules, et calculer le temps passé sur les étapes prises dans cette section. Ajouter six millilitres de solution de séparation cellulaire à un tube centrifuge silicifié stérile. Ajouter la suspension cellulaire diluée au tube.
Après l’ajout de la suspension, une limite claire apparaîtra entre la couche de cellules et la solution de séparation. Ensuite, adhérez une pointe de pipette à la surface intérieure du tube à un angle de 45 degrés. Centrifugeuse la solution superposée dans une centrifugeuse horizontale à 500 fois G pendant 30 minutes.
Après cela, aspirez la deuxième couche nuageuse qui contient les cellules cibles de haut en bas. Transférer les cellules cibles dans un nouveau tube. Ajouter cinq millilitres de PBS pour laver les cellules, et centrifugeuse à 250 fois G pendant cinq minutes.
Répétez ce processus de lavage en ajoutant pbs et centrifugeuse pour un total de trois lavages. Resuspendez la pastille cellulaire avec le milieu d’induction de moelle osseuse. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
Ensuite, ajoutez cinq à huit millilitres de milieu d’induction de moelle osseuse pour obtenir une solution finale de cellules de 300 000 cellules par millilitre. Ajouter un millilitre de cette solution cellulaire à chaque puits d’une plaque de puits de 24 puits. Après avoir incubé les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, aspirez doucement le milieu et ajoutez un millilitre de milieu d’induction ostéoclaste à chaque puits.
Agitez doucement la plaque et retournez-la à l’incubateur. Toutes les 48 heures, retirer et remplacer 0,8 millilitres de milieu d’induction ostéoclaste de chaque puits. Agiter délicatement la plaque avant de la retourner à l’incubateur.
Pour commencer à pré-traiter les tranches osseuses, utilisez une scie micro électrique pour couper le cortex osseux fémoral bovin frais en tranches de deux centimètres d’épaisseur le long de l’axe longitudinal. Après avoir coupé et broyé les tranches, lavez les tranches en les immergeant dans un bécher d’eau déionisée et en les soumettant à l’échographie à 100 hertz pendant une heure. Répétez ce processus de lavage trois fois.
Plonger les tranches lavées dans 75% d’alcool pendant deux heures. Ensuite, aspirez l’alcool et exposez chaque diapositive de tranches à la lumière ultraviolette pendant une heure sur une plate-forme propre. Pour commencer à colorer le bleu toluidine, placez les tranches osseuses prétentiées dans les puits de la plaque de 24 puits.
Après cela, ajouter le milieu de culture dans la plaque de 24 puits pour immerger les tranches osseuses pendant deux heures. Plantez et induisez les cellules comme démontré précédemment. Après que les ostéoclastes sont apparus à quatre à six jours, lavez les tranches avec un millilitre d’hydroxyde molaire d’ammonium de 0,25.
Sonicate les tranches trois fois pendant cinq minutes chacune pour enlever les cellules vivantes et pour permettre l’analyse des fosses de résorption sur les tranches osseuses. Ensuite, retirer l’hydroxyde d’ammonium et tacher les tranches avec un millilitre de 1% de solution bleue toluidine par tranche pendant deux minutes. Laver les tranches de tache avec du PBS.
Sélectionnez au hasard cinq vues et utilisez un logiciel d’analyse d’image pour effectuer une analyse semi-quantitative de la zone de résorption. Tout d’abord, préfixez les tranches d’os avec un millilitre de 2,5% de glutaraldehyde par tranche pendant deux heures à température ambiante. Sonicate les tranches préfixées trois fois pendant trois minutes chacune avec un hydroxyde d’ammonium molaire pour enlever les cellules.
Ensuite, retirez l’hydroxyde d’ammonium et lavez les tranches d’os trois fois avec du PBS, chaque lavage d’une durée de 12 minutes. Fixer les tranches d’os lavées avec 1% d’acide osmique pendant deux heures à température ambiante. Effectuer la déshydratation du gradient d’éthanol tel que décrit dans le protocole textuel.
Après cela, remplacer l’éthanol par de l’acétate d’isoamyle pendant 15 minutes. Enduire les tranches de palladium doré et les analyser en scannant la microscopie électronique. Dans cette étude, un grand nombre de précurseurs ostéoclastes ont été isolés, purifiés et induits avec succès pour devenir ostéoclastes.
En complétant avec M-CSF et RANKL, ostéoclastes géants sont vus les jours cinq à six. La formation de ces ostéoclastes est identifiée avec succès par la coloration des pièges. Les cellules grandes et violettes sont considérées comme des cellules positives TRAP avec plusieurs noyaux.
Grâce à cette méthode, il est typique d’obtenir 800 ostéoclastes contenant jusqu’à 30 noyaux par ostéoclaste dans une plaque de puits 24. Par rapport à la méthode traditionnelle, cette méthode améliorée permet d’économiser environ 20 minutes pendant tout le processus d’isolement. L’utilisation de tranches osseuses pour évaluer l’activité de la résorption osseuse est une méthode in vitro typique.
Grâce à la coloration bleue toluidine, la zone de résorption est visualisée comme vert clair. La structure et les caractéristiques des fosses osseuses peuvent être clairement observées en scannant la microscopie électronique. CTR, l’un des marqueurs cellulaires spécifiques aux ostéoclastes, est essentiel pour identifier les ostéoclastes et étudier la formation d’ostéoclastes dans les os.
L’expression positive du CTR identifie clairement les ostéoclastes et les distingue des polycaryons macrophages. CTR est clairement indiqué dans les analyses d’immunofluorescence par une couleur verte, tandis que le bleu indique les noyaux cellulaires. Assurez-vous de ne pas fracturer les fémurs et les tibias pour éviter de perdre la moelle osseuse.
Une personne qui n’a jamais effectué cette technique avant peut lutter lors de l’aide à la solution de fonctionnement des cellules. La pointe de la pipette doit être adhérente à la surface intérieure du tube et maintenue à un angle de 45 degrés par rapport à la surface intérieure.
