Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie génique, de l’oncolyse et de la vaccination génétique. Il facilite la compréhension et la modulation des interactions des hôtes vecteurs des vecteurs de transfert de gènes adénovirus, le type de vecteur le plus fréquemment utilisé dans les essais cliniques à ce jour. Le principal avantage de cette technique est que les capsulats d’adénovirus peuvent être spécifiquement modifiés d’une manière très définie à des positions sélectionnées et dans une mesure variable en utilisant une chimie simple.
Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie parce que la modification d’hôte vectoriel ne peut pas seulement être analysée mais également modulée d’une manière orientée vers le patient. Bien que cette méthode donne un aperçu des interactions spécifiques de l’hôte vectoriel, elle peut également être utilisée pour l’étiquetage et le suivi des particules virales dans les organismes vivants, tels que les souris. En général, les personnes nouvelles à cette méthode seront aux prises avec la combinaison unique de virologie et de cchimie organique qui nécessite des connaissances pratiques des deux domaines.
La démonstration spéciale de cette technique est essentielle parce qu’ici les méthodes de chimie organique rencontrent des méthodes de biologie cellulaire et de virologie, y compris des tours de manipulation spécifiques au terrain. Pour commencer cette procédure préparer tous les tampons tels que décrits dans le protocole de texte. Pesez un millilitre de chaque tampon de gradient pour vérifier sa densité.
Après avoir stérilisé tous les tampons, parsèmez les tampons contenant du TCEP avec du gaz argon pendant environ 30 secondes pour empêcher l’oxydation du TCEP. Conservez les flacons contenant le moiety en poudre solide de couplage dans de plus grands tubes, chacun rempli d’un coussin de perles de gel de silice, pour empêcher l’accumulation de l’eau de condensateur en décongelant les flacons. Placez ces tubes dans un dessiccateur.
Retirer l’air dans le dessiccateur et le remplacer par du gaz argon. Fermez ensuite chaque tube hermétiquement et transférez-le dans un plus grand récipient avec des perles de gel de silice. Une fois que tous les tubes ont été transférés, fermez le récipient.
Conserver le contenant à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Lorsqu’il est prêt à décongeler, placer le récipient dans une couche de perles de silice dans un dessiccateur. Laissez le récipient chauffer lentement à température ambiante, puis ouvrez le récipient.
Lorsque les cellules atteignent l’effet cytopathique optimal, recueillez-les en raclant les plaques et en transférant le supernatant dans des tubes de centrifugeuse. Faire tourner la suspension cellulaire à 400 fois G pendant 10 minutes. Ensuite, suspendez la pastille cellulaire en quatre millilitres de tampon ad contenant 10 millimolar TCEP et transférez la solution résultante dans un tube stérile de 50 millilitres.
Congeler la solution dans de l’azote liquide, puis la décongeler dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Répétez ce cycle de dégel de gel trois fois pour sauver le vecteur. Centrifugeuse à 5000 G et quatre degrés Celsius pendant dix minutes.
Tandis que le centrifugage a placé deux tubes ultra centrifugeuses pour commencer à préparer deux gradients égaux d’étape de chlorure de césium. Ajouter trois millilitres de la phase inférieure à chacun de ces tubes. Marquer le niveau de la phase inférieure sur le tube avant de charger la phase supérieure.
Puis empilez soigneusement cinq millilitres de la phase supérieure jusqu’à la phase inférieure, le pipetting très lentement le long des murs du tube. Lorsque les gradients sont préparés et que la centrifugation est terminée, chargez également le supernatant de l’échantillon sur les deux gradients. Remplissez l’espace restant dans chaque tube de gradient avec ad-tampon contenant dix millimolar TCEP en s’assurant de remplir les tubes tout le chemin vers le haut.
Réglez le poids des tubes opposés à une différence de poids zéro. Et modifier la centrifugeuse pour 176000 fois G et 4 degrés Celsius pendant deux heures. Après cela, utilisez une pince pour fixer un tube de centrifugation ultra à un support.
S’assurer de laisser la zone autour du niveau de phase inférieure marqué accessible. Placez la lampe à col d’oie au-dessus du tube. Autour de la marque, à la frontière entre les phases inférieure et supérieure, une bande distincte doit être visible.
Perforer le tube à l’aide d’une aiguille et aspirer la bande vectorielle dans une seringue pour recueillir le vecteur. Transférer les virons vecteurs collectés dans un tube de 15 millilitres et calculer la quantité de substrat de couplage nécessaire tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Ensuite, transférez la solution vectorielle dans un tube de taille appropriée.
Et la quantité calculée de raccordement composés solution stock. Mélanger délicatement par rotation aérienne pendant une heure à température ambiante. Ensuite, réglez le volume total de la solution vectorielle à six millilitres en ajoutant un tampon d’annonce.
Purifier le vecteur de la moiety couplage non réagi à l’aide d’une deuxième étape de liaison au chlorure de césium tel que décrit dans le protocole de texte. Percer le tube à l’aide d’une aiguille et aspirer la bande vectorielle dans une seringue. Transférer les vecteurs collectés dans un tube de 15 millilitres.
Si le combiné des deux tubes de gradient est inférieur à 2,5 millilitres, réglez le volume à 2,5 millilitres en ajoutant un tampon ad. Chargez les virons combinés sur une colonne améliorée égale et jetez le flux à travers. Ajoutez ensuite trois millilitres de tampon d’annonce à la colonne et recueillez le flux à travers.
Ajouter 333 microlitres de glycérol au débit recueilli pour obtenir la concentration finale de dix pour cent. Divisez-les en aliquots appropriés. S’assurer d’inclure un aliquot de 20 microlitres pour une détermination plus serrée par la mesure OD 260.
Conserver la solution vectorielle à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Les résultats représentatifs des effets sur 293 cellules indiquent que la production vectorielle est réussie. Les cellules doivent présenter une morphologie 40-48 heures après avoir été inoculées avec le vecteur du virus.
Le phage SDS taché d’argent est ensuite utilisé pour évaluer l’efficacité du couplage. Des vecteurs avec des Cystein introduits dans la base de pentone de capsomere avec l’hexon modifié et non modifié sont exécutés. Les bandes hexon présentent un décalage indiquant une modification réussie de plus de 90 pour cent des monomères par capside.
Tout en essayant cette procédure, il est important d’assurer un environnement de réduction pour les particules vectorielles non modofiées. Après modification, une atmosphère régulière convient. Des calculs documentaires précis doivent assurer la modification quantitative de toutes les particules vectorielles.
Le développement de cette technique aide la recherche dans le domaine de la thérapie génique à explorer davantage les stratégies sûres et déficientes pour la livraison vectorielle. Suivant cette procédure, d’autres méthodes comme le couplage des ligands pour le ciblage ou les colorants fluorescents pour l’étiquetage peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme l’utilisation des récepteurs et la biodissuration. S’il vous plaît assurez-vous d’obéir à vos OGM locaux et règlements sur la sécurité au travail.
