Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine du développement postnatal sur la façon dont la t allaite du lait influence la signalisation du stress dans le cerveau. Cette technique peut être utilisée pour capturer des zones spécifiques du cerveau au cours de la première période naturelle de famine et pour les comparer à des zones respectives peu de temps après la première alimentation naturelle de colostrum. Comprendre comment la t allaiterie influence la physiologie du comportement et de l’émotion permet l’utilisation d’un antagoniste à divers récepteurs lors de l’analyse des tissus cérébraux ex vivo.
Pour obtenir les poinçons des noyaux, retirez les chiots rat par leur queue avec une main gantée. Après la récolte du cerveau, placez rapidement l’organe entier dans un moule méthacrylate polyméthyle du cerveau à température ambiante et utilisez immédiatement une nouvelle lame de rasoir pour faire 500 micromètres d’épaisseur des tranches du tissu. Déposer les tranches rostral à caudale dans une boîte de Pétri car elles sont obtenues pour maintenir l’orientation correcte des sections.
Lorsque tout le cerveau a été sectionné, ajouter rapidement le liquide céphalo-rachidien cérébral artificiel sans glucose au plat et incuber les tranches pendant 60 minutes à 28 à 30 degrés Celsius avec agitation constante sur un shaker orbital. Utilisez un atlas cérébral et des repères anatomiques sur chaque tissu pour identifier les noyaux du cerveau à percer et placer la tranche avec les noyaux d’intérêt dans une nouvelle boîte de Pétri sous un microscope dissection. Une fois visualisé, utilisez un outil de carottage pour percer rapidement quatre à six noyaux différents et plonger rapidement chaque noyau perforé dans 0,06 mL de tampon d’extraction de protéines glacées dans le tube de micro-centrifugeuse dûment étiqueté contenant des inhibiteurs du protéine et des inhibiteurs de la phosphatase pendant 60 minutes.
À la fin de l’incubation, centrifuger les noyaux extraits dans une mini-centrifugeuse refroidie et utiliser une micro-pipette pour transférer soigneusement 0,055 mL de supernatant de chaque tube dans le tube de micro-centrifugeuse pré-refroidi approprié de 1,5 mL sur la glace. Avant le stockage négatif de 20 degrés Celsius, transférez 0,012 mL de supernatant de chaque tube de stock protéique dans le tube pré-refroidi approprié de 0,5 mL sur la glace pour la première préparation de l’échantillon. Pour préparer les échantillons à la mesure des protéines capillaires, ajoutez 0,003 mL de réagentineur de mélange principal à partir d’une trousse de lyse protéique à chacun des échantillons des tubes étiquetés de 0,5 mL.
Ensuite, ajoutez 0,004 mL de reagent de mélange principal à une solution biotinylée d’échelle de poids moléculaire dans 0,016 mL d’eau déionisée, et dénaturez les échantillons d’échelle et d’extrait de protéines dans un bloc thermique de 95 degrés Celsius, stockant tous les tubes à quatre degrés Celsius après cinq minutes. Pour l’analyse des protéines de signal, ajouter 0,01 mL de solution de peroxyde de luminol fraîchement préparée aux puits E-1 à E-25 d’une nouvelle plaque occidentale automatisée, 0,01 mL d’anticorps anti-souris secondaire aux puits D-2 à D-25, et ajouter 0,01 mL de peroxyde de raifort streptavidine du kit au puits D-1. Ajouter 0,01 mL d’anticorps primaires fraîchement préparés dans les puits C-2 à C-25, et 0,01 mL d’anticorps diluant deux solutions aux puits C-1 et B-1 à B-25.
Laissez les puits de la rangée F vides et remplissez les cinq compartiments des trois rangées sous la rangée F avec 0,45 mL de tampon de lavage. Ensuite, faites tourner brièvement les échantillons réfrigérés pendant 30 secondes et ajoutez 0,03 mL de chaque échantillon à chaque puits de la rangée A, en commençant par A-2. Ensuite, ajoutez 0,005 mL de l’échelle de poids moléculaire biotinylée au puits A-1 et couvrez la plaque pour la centrifugation.
Pendant que la plaque est centrifugée, ouvrez un nouveau fichier de course dans le logiciel automatisé associé à l’Ouest et lancez un test de taille moléculaire. Dans la page d’analyse, entrez les noms de l’échantillon dans chaque capillaire ainsi que les noms des anticorps primaires et secondaires. À la fin de la centrifugation, placez la plaque dans l’instrument occidental automatisé et pelez le couvercle de la boîte de cartouche capillaire.
Après centrifugation, n’oubliez pas d’inspecter les bulles d’air, car les bulles d’air dans le capillaire peuvent bloquer le courant électrophoretic et échouer tout le cycle. Insérez la cartouche dans la position désignée à l’intérieur de l’instrument et fermez la porte. Cliquez sur démarrer.
Lorsque vous êtes invité avec le type d’analyse, entrez le nom de l’expérience dans la boîte de texte appropriée et cliquez bien. Lorsque la date d’exécuteur activée et le numéro d’identification du fichier d’exécuteur sont invités, notez l’heure à laquelle l’exécuter se termine. À la fin de la course, jeter la cartouche capillaire dans l’élimination des objets tranchants et la plaque dans l’élimination des matériaux biodangereux.
Après la séparation de l’électrophoresis, vérifiez les fichiers de course pour les pics de réactivité immunitaire des antigènes à 40 à 43 kilodaltons qui signifient phosphorylated facteur d’initiation à la traduction eucaryotique 2A. Lorsque des pics de poids moléculaire de cette taille sont manquants, cliquez à droite en dessous de la courbe et sélectionnez ajouter du poids moléculaire au pic pour s’assurer que les tailles et les quantités arbitraires en dessous de la courbe sont enregistrées. Dans les échantillons de tissus non amorcés, les niveaux contraignants de protéines globulines aminés dans les noyaux de la voie solitaire sont significativement plus élevés que dans toutes les autres régions.
L’amorçage du tissu intestinal avec colostrum diminue les niveaux contraignants de protéine de globulin aminé dans les noyaux de la voie solitaire et n’a aucun effet sur les noyaux paraventriculaires et les noyaux super-optiques. Inversement, l’amorçage augmente les niveaux contraignants de protéine d’amibuline dans le cortex, les noyaux de striation, et les noyaux préoptiques médiaux par rapport au tissu non amorcé, impliquant que les niveaux liants de protéine de globulin aminé dans les divers noyaux éprouvés de cerveau répondent différemment à l’amorçage d’intestin et il n’y a pas encore de tige croisée démontrée entre les différents noyaux examinés. Le facteur d’initiation eucaryotique de traduction 2A et les niveaux eucaryotes phosphorylated d’initiation de traduction 2A sont élevés dans l’état non amorcé par rapport à d’autres noyaux.
Après amorçage, les niveaux du facteur d’initiation eucaryotique de traduction 2A et du facteur phosphorylated d’initiation eucaryotique de traduction 2A sont réduits par rapport aux noyaux de la voie solitaire comparés au tissu non amorcé. Dans tous les autres noyaux testés, l’amorçage augmente les niveaux de facteur d’initiation à la traduction eucaryotique 2A et de facteur d’initiation eucaryotique phosphorylated 2A par rapport au tissu non amorcé. Cependant, les niveaux du récepteur phosphorylated de kinase de protéine sont bas dans les échantillons non amorcés par rapport aux échantillons amorcés dans les noyaux de la voie solitaire, suggérant fortement qu’un autre kinase soit impliqué dans la phosphorylation du facteur d’initiation eucaryotique de traduction 2A.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement postnatal afin d’explorer les voies de signalisation impliquées dans la croissance et la différenciation des tissus et si elles sont influencées ou indépendantes de la t allaite. N’oubliez pas que travailler avec des agents réducteurs volatils comme, par exemple, le dithiothreitol, peut être dangereux, et des précautions telles que la préparation dans le capot chimique doivent toujours être prises lors de la préparation de cette procédure.
