Ces méthodes peuvent aider à répondre aux questions clés dans le domaine des biomatériaux. En particulier pour la régénération osseuse. Ils sont utilisés pour évaluer l’efficacité des biomatériaux et les réponses immunitaires potentielles.
Le principal avantage de cette plate-forme multidisciplinaire est qu’elle fournit une gamme de paramètres pour prédire la biocompatibilité des biomatériaux utilisés pour la réparation osseuse. Les implications de ces techniques osseuses in vitro et in vivo s’étendent à d’autres troubles osseux. En raison de la nécessité d’un dépistage préclinique de nouveaux biomatériaux orthopédiques.
La méthodologie dermatologique peut fournir un aperçu des biomatériaux pour la guérison osseuse, il peut également être appliqué aux évaluations biomatériaux pour toute autre indication clinique. Aspirer le milieu de culture des ostéoblastes primaires 14 jours après l’ajout du milieu ostéogénique de minéralisation. Rincer deux fois avec 0,5 millilitres de 1X PBS.
Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 0,5 millilitres de solution formaline tamponnée à 10 % et en couveant à température ambiante pendant 10 minutes. Après 10 minutes, aspirer la formaline tamponnée à 10 % avec un pipet à usage unique et laver deux fois avec 0,5 millilitres d’eau ultrapure. Ajouter ensuite 250 microlitres de solution de coloration Alizarin Red S de 40 millimolaires aux ostéoblastes fixes.
Et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes sur un shaker à 100 shakes par minute. Après l’incubation avec la solution de coloration, aspirer la solution de coloration avec un pipet à usage unique et rincer avec un millilitre d’eau ultrapure. Répétez cette étape cinq à dix fois jusqu’à ce que la solution de rinçage se dégage clairement pour enlever les taches non spécifiques.
Après avoir aspiré le lavage final, ajouter un millilitre de PBS froid. Et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes sur un shaker comme avant. Ensuite, transférez les disques tachés de phosphate bêta tricalcium dans un nouveau puits et numérisez les plaques à l’aide d’un scanner à plate-forme pour enregistrer la minéralisation.
Après la capture d’image, ajouter 250 microlitres de 10% de solution de chlorure de cetylpyridinium et agiter pendant 15 minutes pour extraire le colorant Alizarin Red S. Ensuite, transférez la solution des puits aux tubes individuels de 1,5 millilitres et à la centrifugeuse à 17 000 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Diluer l’extrait avec 10% de solution de chlorure de cetylpyridinium à une ration de dilution de 1:10 à 1:20 dans un tube de 1,5 millilitre.
Transférer ensuite 300 microlitres de chaque échantillon dilué dans les puits de la plaque de 96 puits. Inclure deux puits vierges contenant seulement 10 % de chlorure de cetylpyridinium. Ensuite, préparez sept normes de référence Alizarin Red S allant de 4 400 micromolaires en diluant la solution de coloration Alizarin Red S de 40 milliomolaires avec une solution de chlorure de cetylpyridinium à 10 % pour générer une courbe standard.
Chargez 300 microlitres de chaque norme dans la plaque. Enfin, lisez les absorbants des échantillons, des blancs et des normes de référence à 520 nanomètres. Isoler les précurseurs de l’ostéoplaste de moelle osseuse des fémurs et du tibia d’une souris euthanasié en utilisant des ciseaux stériles pour enlever les jambes du corps à l’articulation de la hanche.
Couper les membres aux articulations du genou et de la cheville et enlever les tissus mous avec le scalpel stérile et les forceps. Coupez les épiphyses. Insérer une aiguille de calibre 27 attachée à une seringue remplie d’un millilitre de milieu de croissance osseuse dans le lumen et rincer la moelle dans une boîte de Pétri stérile de six centimètres.
Après avoir répété cela pour tous les fémurs et tibiae, transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 50 millilitres. Laver la boîte de Pétri de six centimètres avec cinq millilitres de milieu de croissance osseuse et la transférer dans le même tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse à 350 x g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Après centrifugation re-suspendre les cellules en un millilitre par puits de milieu de différenciation ostéoclaste. Une souris BALB/c fournit un nombre suffisant de précurseurs ostéoclastes pour une plaque de culture de 24 puits. Ajouter les ostéoblastes primaires suspendus dans le milieu de croissance osseuse sur le biomatériau et les contrôles à 8,8*10^4 cellules par centimètre carré.
Des disques de phosphate de tricalcium bêta, l’os bovin commandé, et le plastique de culture de tissu sont utilisés ici. Incuber à 37 degrés Celsius en cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après 24 heures, ajouter des précurseurs ostéoclastes de moelle osseuse fraîchement isolés et un milieu de différenciation ostéoclaste aux ostéoblastes primaires cultivés et retourner à l’incubateur pour cinq jours de culture à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone.
Remplacez le milieu par un milieu de différenciation ostéoclaste fraîchement préparé tous les deux jours. Tacher ensuite les ostéoclastes pour la phosphatase acide résistante au tartrate pour évaluer la différenciation. Raser le cuir chevelu d’une souris BALB/c anesthésiée de huit semaines et nettoyer la surface avec une solution d’iode à 7,5 % de povidone et 70 % d’éthanol.
Couvrez les yeux d’onguent ophtalmique pour éviter le séchage pendant l’intervention. Assurer un niveau approprié d’anesthésie par manque de réaction à un pincement d’un outeil et de la queue. Puis, après avoir fait une incision sagittale midline enlever les tissus conjonctifs paracranium au-dessus de l’os pariétal droit en le raclant avec un scalpel.
Ensuite, utilisez une tréphine dentaire stérile d’un diamètre de quatre millimètres à 2000 rotations par minute pour créer un défaut de taille critique dans l’os pariétal droit. Irriguer constamment la région avec la solution saline stérile tout en encoche l’os pariétal droit et en coupant à travers l’ectocortext et un peu d’endocortex. Pour éviter les dommages au Dera Mater, utilisez un petit ascenseur periosteal pour percer l’endocortex restant.
Ensuite, utilisez des forceps pour soulever soigneusement l’os calvarial et l’enlever. Le défaut qui en résulte doit être circulaire et d’environ 3,5 millimètres de diamètre. Ensuite, remplissez le défaut calvarial avec la mousse de collagène de phosphate de tricalcium bêta, présoaked dans PBS stérile.
Pour maintenir le biomatériau en place, appliquez 0,5 microlitres d’adhésif tissulaire à la fin du défaut à deux points opposés. Ensuite, fermez la peau avec une suture nonabsorbable. Placez une souris anesthésiée sur le dos, rasez la fourrure abdominale et nettoyez la surface rasée avec une solution d’iode à 7,5 % de povidone et 70 % d’éthanol.
Après avoir fait une incision médiane de huit millimètres de long à travers la peau le long du linea alba de l’abdomen, implant PBS imbibé biomatériau sous la peau. Puis suture de la peau avec une suture nonabsorbable. Huit semaines après l’implantation, exciser le site d’implantation avec les tissus environnants de la souris euthanasiée.
Cette image démontre que la croissance sur les disques de phosphate de bêta-tricalcium montrés dans les barres ouvertes n’affecte pas la viabilité d’osteoblast comparée à la croissance sur le plastique de culture de tissu à sept et 14 jours de culture. Des ostéoblastes cultivés ont été tachés avec Alizarin Red S après 14 jours. La minéralisation était plus élevée pour les contrôles moyens de minéralisation que pour les ostéoblastes cultivés dans le seul milieu.
Et sur les disques de phosphate bêta tricalcium dans les puits de culture de suspension. Quand un défaut calvarial chirurgicalement-induit de taille critique a été laissé vide, une couche mince couvrant le défaut entier a été observée, mais aucune formation significative d’os n’était présente à 12 semaines après opération. En revanche, quand le défaut a contenu la mousse bêta de collagène de phosphate de tricalcium, les restes de mousse entourés du tissu fibreux dense comprenant quelques vaisseaux sanguins et cellules inflammatoires ont ponté la zone de défaut sans évidence de formation d’os.
Après l’implantation sous-cutanée de mousse de collagène de phosphate de bêta-tricalcium, une réponse inflammatoire avec des cellules géantes étrangères de corps a été observée sur des sections hematoxyline et eosin-souillées une évidence de fibrose sur Masson' sections trichromes tachées à huit semaines. En revanche, le site d’implantation des contrôles factices a eu l’inflammation minimale et aucune fibrose. Tout en essayant cette procédure, il est important de faire des ensemblages précis et reproductibles du calvarium sans blesser l’animal.
Suivant les autres méthodes de cette procédure comme les tests de différenciation ostéoclaste et le débit élevé dans les modèles immunitaires péritonéaux peuvent être préformés afin de répondre à des questions supplémentaires comme la réponse de l’ostéoclaste aux biomatériaux et le type de réponse immunitaire.
