Cette méthode permet un dépistage in vivo rapide chez la souris, de l’effet d’un transgène, et est spécifiquement adaptée pour effectuer des études de gain ou de perte de fonction, ainsi qu’une cartographie des motifs de réponse et d’ADN. Le principal avantage de cette technique, est que l’utilisation de prédiction des animaux transgéniques sont au-dessus de 70% du nouveau-né et peuvent être appliquées à toutes les souches de souris, y compris les animaux transgéniques. Après avoir euthanasié les souris, recueillir les oviductes.
Pour commencer la chirurgie, utilisez des ciseaux pour faire une grande incision horizontale dans la cavité abdominale. Ensuite, localiser l’oviducte entre l’utérus et l’ovaire. Ensuite, utilisez des forceps incurvés pour enlever le mésometrium et la membrane avec les vaisseaux sanguins proéminents.
Ensuite, séparez l’oviducte de l’ovaire et disséquez l’oviducte de l’ovaire. Puis, tirez sur l’oviducte et coupez loin de l’utérus. Transférer tous les oviductes collectés au milieu M2 à température ambiante.
Lors de la manipulation des oviductes, veillez à éviter de toucher l’ampulla gonflée chargée d’œufs fécondés. Ensuite, ajoutez une goutte de 100 microlitres de solution de travail hyaluronidase à un plat de 10 centimètres. Ensuite, transférer les deux oviductes en elle, pour enlever les cellules cumulus des œufs.
Sous un stéréomicroscope, utilisez une paire de seringues à insuline pour fixer l’oviducte tout en déchirant l’ampulla et en dispersant les œufs fécondés. Ensuite, utilisez une pipette en verre préparé avec tube et un embout buccal pour aspirer tous les oeufs. À l’aide de cet outil, transférez-les entre six gouttes de milieu M2 pour laver les cellules cumulus environnantes.
Ensuite, transférer les œufs lavés dans un puits de 10 millimètres, dans une assiette de quatre puits, remplie de préchauffé avec M16. Ensuite, transférez le plat dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius. En préparation, centrifugeuse la suspension vectorielle lentivirale préparée à 160 g pendant deux minutes, pour granuler les débris souvent présents dans le stock lentiviral.
Dans une armoire de sécurité de classe deux, transférez les supernatants dans un nouveau tube de 0,5 millilitre. Ensuite, chargez un microlitre de supernatant, dans une pipette d’injection. Ensuite, fixez la pipette d’injection au micromanipulateur latéral droit.
Et fixez la pipette de fixation au micromanipulateur latéral gauche. Maintenant, distribuez huit microlitres de milieu M2 au centre de la glissade de dépression. Et couvrir d’huile de parafin léger pour éviter l’évaporation.
Ensuite, placez 20 œufs dans les endroits peu profonds de la goutte sans créer de bulles. Ensuite, assurez-vous que la pointe de la pipette d’injection est ouverte. Sinon, appuyez sur la pipette d’injection avec la pipette de fixation pour l’ouvrir.
Ensuite, réglez le microinjecteur pendant 20 secondes. Maintenant, en utilisant la pipette de fixation et la pression manuelle aspirer un ovule fécondé qui contient deux pronucléi et deux corps polaires. Ensuite, à l’aide de la pipette d’injection injecter l’espace périvitelline de l’œuf.
Ne touchez pas la membrane plasmatique. Ajustez la pression de sorte que l’espace périvitelline soit rempli de solution. La pression ne doit pas dépasser 600 hecto pascals.
Immédiatement après l’injection des 20 œufs, transférer le lot dans un bain de milieu M16 préchauffé. Et les incuber pendant au moins 30 minutes avant de les implanter. 16 heures après l’accouplement des femelles normales aux mâles avec des vasectomies, vérifiez les bouchons de copulation.
Utilisez ces femelles pour l’implantation. Ensuite, faire des pipettes d’implantation avec un diamètre interne d’environ 150 microns. Et avec des pointes polies par la flamme qui mesurent environ quatre à cinq millimètres de long.
Chargez une pipette avec de l’huile de parafin légère testée à l’embryon juste au-dessus du point d’épaule. Ensuite, aspirez une petite bulle d’air et chargez davantage la pipette avec le milieu M2. Ensuite, aspirez une deuxième bulle d’air.
Maintenant, dessinez les embryons dans la pipette l’un derrière l’autre, en minimisant le volume de milieu entre les embryons. Terminer, en aspirant une très petite goutte d’huile de parafin d’un seul embryon de large. La préparation de la pipette de réimplantation est essentielle et nécessite beaucoup de pratique.
Les oeufs dans la pipette doivent être alignés avec pratiquement aucun milieu entre eux. Ensuite, après anesthésier la souris et confirmer l’anesthésie avec une pincée d’un pied Raser deux, deux centimètres de bandes de cheveux le long de la moelle épinière au niveau de la dernière côte. Maintenant, placez la souris sur un coussin chauffant sur un champ stérile et drapez-la, laissant une fenêtre à la peau exposée.
Ensuite, assainir la peau exposée avec des gommages alternatifs d’iodoprovidone et 70 pour cent d’éthanol. Pour l’implantation, faites d’abord une incision transversale d’un centimètre, puis faites glisser la peau latéralement jusqu’à ce que l’ovaire de couleur orange soit visible à travers la paroi du corps. Ensuite, faites une incision de cinq millimètres avec les ciseaux fins et ramasser la garniture de graisse avec une pince atraumatic bulldog.
Une fois la garniture saisie, retirez l’ovaire, l’oviducte et le haut de l’utérus. Ensuite, localisez l’ampulla et faites une hémisection avec ciseaux vannas, sur le segment des oviductes qui relie l’ovaire à l’ampulla. Ensuite, introduire la pipette embryon de transfert et éjecter les œufs.
Arrêt à la première bulle d’air après que les oeufs ont été libérés. Préparer les matériaux nécessaires pour répéter la procédure sur le deuxième oviducte. Et une fois terminé, fermez la peau avec des pinces à plaies.
Immédiatement après la fermeture de la peau, injecter intraperitonealy analgésique et placer l’animal dans la chambre de récupération avec un élément de chauffage de 39 degrés Celsius. Surveillez jusqu’à ce qu’il soit complètement éveillé. L’animal transgénique ont été générés utilisant la méthode présentée.
Un vecteur lentiviral de haut litre a été produit utilisant un exhausteur de base de 2,3 kilos pour neurogenin-3 pour conduire eGFP. Ou comme un contrôle, un fragment de chromosome six pour conduire eGFP. L’intégration dans les embryons a été assez réussie.
À partir des embryons, le bourgeon pancréatique a été sectionné et immuno taché pour rechercher l’expression localisée de l’eGFP. Plus de 90 pour cent des vecteurs, avec l’exhausteur neurogenin-3, ont exprimé l’eGFP dans neurog3 exprimant des cellules. Cependant, aucun des vecteurs de lutte intégrés n’a exprimé eGFP dans le bourgeon pancréatique.
Les sites d’intégration transgéniques ont été évalués par PCR quantitatif, en utilisant le gène CDX2 comme un contrôle. Le nombre moyen de sites d’intégration était d’environ 20 à l’aide de la construction Neurogenin-3, ou 10 en utilisant la construction de contrôle. Curieusement, le titer de transduction virale utilisé pour la construction Neurogenin-3, était environ le double du vecteur de lutte.
Suggérant une relation entre le titer de transduction et le nombre d’intégrations. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer un grand nombre d’embryons transgéniques fondateurs en utilisant l’injection périvitelline de vecteurs lentiviraux avec une grande efficacité. Une fois maîtrisée, cette technique peut produire jusqu’à 50 animaux fondateurs en un seul jour de microinjection, si elle est effectuée correctement.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’injection pronucléaire d’ADN de titer peuvent être exécutées, afin d’établir des lignes transgéniques de souris. N’oubliez pas que le travail avec les vecteurs lentiviraux est soumis à l’autorisation de votre comité local d’OGM. Ces vecteurs peuvent être extrêmement dangereux et des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
