Ce travail a été soutenu par une subvention Joseph P. Healey de l&#39;Université du Massachusetts à Boston (LSH) et R15 GM86805 du NIH (LSH). SMP est supporté en partie par une Sanofi-Genzyme Fellowship à l&#39;Université du Massachusetts à Boston.

1. Préparation de sporulation Remarque:. Les milieux décrits dans ce protocole sont réalisés en utilisant des recettes et des méthodes standard 13,17 Le tableau 1 donne la formulation pour 1 L des différents médias utilisés dans ce protocole. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" height="180" width="469"><colgroup><col /><col /><col span="3" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"></td><td style="width: 55px;"> bactopeptone </td><td style="width: 50px;"> Extrait de levure </td><td style="width: 50px;"> gélose Bacto </td><td style="width: 60px;"> Dextrose </td><td style="width: 70px;"> L&#39;acétate de potassium </td><td style="width: 60px;"> Glycérol </td><td style="width: 60px;"> ddH 2 O </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> plaques GPJ </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 30 ml </td><td> 970 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> des boîtes de YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> 20 g </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> liquide YPD </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td height="15" style="height:20px;"> liquide YPA </td><td> 20 g </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> - </td><td> 20 g </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr><tr height="15"><td style="height: 20px; width: 80px;"> médias sporulation </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 g </td><td> - </td><td> 1000 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Formulations des médias Les montants sont donnés pour 1 L de médias. Spécificités sur les médiasles ingrédients peuvent être trouvés dans la table des matières. <ol><li> Si toutes les cellules sporulantes sera le même Génotype, suivez cette procédure: <ol><li> la souche de levure Thaw à utiliser sur un (YPGlycerol) plaque GPJ. Cultivez levure pour 12-16 heures à 30 ° C. Fait important, les cellules SK1 sont également prêts à sporuler, donc les souches SK1 ne doivent pas être laissés trop longtemps sur des plaques de GPJ, ou ils peuvent sporuler sur la plaque. Remarque: Une souche fraîchement décongelé cultivée sur YPG est préféré, que l&#39;utilisation du glycérol comme source de carbone nécessite la phosphorylation oxydative, et sélectionne ainsi les cellules qui ont l&#39;ADN mitochondrial fonctionnel. les cellules SK1 ont tendance à perdre de l&#39;ADN mitochondrial fonctionnel et devenir petites. L&#39;ADN mitochondrial fonctionnelle est nécessaire pour la sporulation. </li><li> Streak levure à partir de la plaque de GPJ sur un YPD (YPDextrose) plaque pour des colonies isolées. Cultiver la levure sur la plaque YPD 24-28 h à 30 ° C. </li><li> Après environ 36-48 h de la croissance sur YPD milieux solides, démarrer une culture YPD 25 ml en utilisant une seule coloniede la plaque YPD. Cultivez cette culture jusqu&#39;à ce que les cellules sont sur ​​DO 600 = 4,0 à 7,0. Effectuez cette étape à 30 ° C pendant la nuit dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute. </li><li> De la culture YPD, utiliser une quantité appropriée de cellules pour démarrer 1000 ml de YPA (YPAcetate) culture qui est DO 600 = 0,1 pour chaque besoin plaque à 96 puits dans la section 2. Cultiver la levure dans un incubateur agitateur à 30 ° C (agitation à 220 rpm) jusqu&#39;à ce que la DO600 de la culture est compris entre 1,3 et 1,5. Note: inoculer 100 ml de culture LPJ pour chaque plaque multipuits 96 à cribler dans la section 2. Par exemple, si le dépistage quatre 96 plaques multipuits, 400 ml de culture LPJ seront nécessaires. A partir de 10% du volume supplémentaire dans la culture LPJ est nécessaire pour protéger contre la perte de volume par évaporation. En règle générale, il faudra compter entre 12-16 h pour les cellules pour atteindre la DO appropriée 600; la durée peut varier en fonction du génotype de la souche de levure. LPJ est le média de présporulation. préculturedans de l&#39; acétate aide induire l&#39; expression des gènes (comme IME1) nécessaire pour efficace et synchrone sporulation 6. </li><li> Spin à 1.800 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min pour sédimenter les cellules cultivées dans LPJ. Laver les cellules 1x avec 0,5 volume d&#39;eau désionisée autoclavée stérile. Spin à nouveau, et jeter laver. Resuspendre les cellules dans les médias 1x volume de sporulation. Continuer à la section 2. </li></ol></li><li> Si l&#39; utilisation de cellules pour sporulation qui sont des génotypes différents, (c. -à- transformées avec des plasmides différents ou contenant différentes mutations, généralement obtenues et stockées sous forme de stocks congelés), des cellules de tableau des différents génotypes dans un format 96 multipuits. Ensuite, suivez cette procédure: <ol><li> Utilisez un 96 broches frogger stérile pour transférer des cellules à partir de stocks congelés décongelés dans 96 plaque (s) multipuits sur YPG milieux solides. Cultiver la levure pendant la nuit à 30 ° C. </li><li> Utilisation d&#39;un 96 broches frogger stérile, transférer les cellules de YPG milieux solides sur YPD milieux solides ou sélectiveun milieu solide ( par exemple, un milieu minimal synthétique dépourvu des acides aminés, si les cellules contiennent des plasmides qui nécessitent une sélection). Cultiver la levure à 30 ° C jusqu&#39;à ce que les colonies sont formées pour chaque souche, typiquement 1 jour sur YPD et 2 jours si des milieux sélectifs est nécessaire. </li><li> Aliquoter 1,2 ml de milieu liquide YPD ou des milieux liquides sélectifs dans chaque puits d&#39;une plaque multipuits 96 profondeur de 2 ml. Transfert des cellules à partir de supports solides dans des milieux liquides en utilisant un frogger, couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban, et de croître pendant une nuit dans 30 ° C shaker, agitation à 220 rpm. Remarque: Pour minimiser la contamination, des plaques de couverture en utilisant les couvercles en plastique à partir d&#39;une boîte de Pétri rectangulaire. Tenir les paupières en place au moyen d&#39;un morceau de ruban adhésif, de sorte que la circulation de l&#39;air est très peu limité. </li><li> plaques centrifuger à 1800 xg pendant 5 min, en utilisant un seau centrifuge oscillant avec des adaptateurs pour accueillir plaques à 96 puits. Décanter médias de cellules; ajouter 500 ul LPJ à chaque puits et resuspendre cellules sédimentées dans la LPJ. Couvertureavec couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. </li><li> Cultiver les cellules pendant 15 heures à 30 ° C dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute. Continuer à la section 2. </li></ol></li></ol> 2. Les cellules sporulantes dans un 96 Multiwell Format <ol><li> Ajouter un ou l&#39;autre de 3 mm perle de verre solide stérile ou un stériles 5 mm x 2 mm barre d&#39;agitation magnétique dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits avec 1,3 ml de puits. (Voir résultats représentatifs ci - dessous pour une discussion sur l&#39; opportunité d&#39;utiliser un cordon ou d&#39; une barre d&#39;agitation.) </li><li> Si toutes les cellules à cribler sont du même génotype, aller à 2.2.1. Si les cellules à cribler sont de différents génotypes, aller à 2.2.2. <ol><li> Prenez des cellules de l&#39;étape 1.1.5 et aliquote de 500 pi de cellules plus les médias dans chaque puits de la plaque multipuits 96. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3. </li><li> les cellules de spin qui sont LPJ de 1.2.4 à 1800 g pendant 5 min, en utilisant une centrifugeuse à godet oscillant avec des adaptateurs pour recevoir des plaques à 96 puits. verser def support de cellules. Ajouter 500 ul de milieu de sporulation dans chaque puits et les remettre en suspension les cellules sédimentées dans le milieu de sporulation. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3. </li></ol></li><li> Si vous utilisez une perle de verre, placer les échantillons dans un incubateur sous agitation à 30 ° C et agiter à 220 rpm pour la sporulation. Si vous utilisez une barre d&#39;agitation magnétique, placer les échantillons sur une plaque d&#39;agitation à l&#39;intérieur d&#39;un 30 ° C incubateur pour sporulation. Remarque: La vitesse d&#39;agitation exacte pour les barres d&#39;agitation magnétique est pas très important, aussi longtemps que toutes les barres se déplacent énergiquement et la culture est aéré. </li><li> Pour surveiller la progression à travers la sporulation, prélever des échantillons de la culture sporulée pour la visualisation, Ajouter 6 ul de cellules à partir des cultures sporulées à 24 pi de milieu de sporulation dans une plaque à 96 puits lamelle couvre-objet (1: 5 de dilution). Laisser les cellules se contenter de 5 minutes avant d&#39;examiner les cellules en utilisant un microscope inversé. Remarque: Dans les cellules SK1 de type sauvage, les spores matures compacts formeront par 36 heures après le transfert aux médias de sporulation. La progression à travers la sporulation peut être contrôlée par microscopie en utilisant des marqueurs fluorescents, comme un marqueur nucléaire (c. -à -HTB2 mCherry 18) pour examiner la méiose ou un marqueur de la membrane ProSpore (c. -à- G20 19) pour examiner la morphogenèse des spores. En variante, la formation de spores réfringents peut être vu à l&#39;aide de DIC Nomarski microscopie à partir d&#39;environ 12 heures après le transfert au milieu de sporulation. </li></ol>

<ol>
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The authors have no competing financial interests.

Nous présentons ici un protocole de sporulation SK1 levure dans un format de 96 multipuits. Aération est la clé pour la sporulation efficace, ce qui nécessite l&#39;utilisation soit d&#39;un barreau d&#39;agitation ou une perle de verre dans chaque puits. Lorsque les cellules sont sporulés dans une plaque multipuits 96 dans un incubateur à agitation sans soit une perle ou une barre d&#39;agitation, les cellules ne sporulation pas efficacement. Seule une petite augmentation de l&#39;efficacité de la sporulation est observée lorsque les cellules sont sporulés sans soit une perle ou une barre d&#39;agitation dans un incubateur à agitation, par rapport à l&#39; être à 30 ° C sans agitation (tableau 1, 17% dans un shaker vs 10% placé sur un émoi assiette). De même, l&#39;utilisation d&#39;une barre d&#39;agitation 7 mm a donné lieu à l&#39;efficacité de sporulation pauvres (28%), probablement parce que les 7 mm remuent barres n&#39;aèrent la culture correctement en raison d&#39;interactions avec les barres d&#39;agitation dans les puits adjacents. Ce protocole décrit les conditions de sporulation utilisant le synchroniquement et efficacement sporulation SK1 souche de levure 7,8 utilisée couramment pour étudier sporulation; l&#39;efficacité de la sporulation qui peuvent être obtenus avec d&#39;autres souches de levures qui utilisent ce protocole devraient être examinés avant d&#39;entreprendre un grand écran en utilisant ces techniques. Bien qu&#39;un 5 mm x 2 mm les résultats de la barre d&#39;agitation dans un peu mieux sporulation par rapport à l&#39;utilisation d&#39;une perle de verre (66% avec 5 mm x 2 mm barre d&#39;agitation vs 56% avec une perle de verre), le coût nécessaire pour acheter suffisamment de bruit barres pour chaque puits peuvent être prohibitifs. Les rendements de sporulation obtenus en utilisant une bille de verre offre une solution à faible coût qui crée assez d&#39; aération pour le criblage à haut débit dans un format multipuits 96 16. Malheureusement, l&#39;ajout d&#39;une barre d&#39;agitation ou une perle de verre n&#39;a pas atteint l&#39;efficacité de sporulation très élevées (typiquement ~ 80% ou plus) vu quand sporulation dans des flacons, et phénotypes de sporulation ainsi subtiles peut être difficile à détecter lors de la sélection dans un 96 puits format. Contrairement aux méthodes précédemment décrites 9-13 sporulation </sup&gt; qui utilisent des milieux solides ou de plus grands volumes de supports liquides en utilisant des flacons ou des tubes de culture, ce protocole décrit les conditions de sporulation efficace dans un format de 96 multipuits. L&#39;utilisation d&#39;un format de 96 puits multiples est compatible avec différents types de criblages à haut débit qui peut être effectuée pour examiner les phénotypes de la sporulation. Par exemple, les écrans chimiques qui affectent le processus de sporulation peuvent être réalisées à l&#39;aide de cette technique, dans laquelle les cellules sporulantes sont traitées avec des composés différents qui ont été disposées dans un format à 96 puits. Dans ce cas, les cellules à sporuler seraient toutes du même génotype et les composés seraient ajoutés à l&#39;étape 2.2 de la sporulation. Ce protocole est également compatible avec le criblage des cellules de différents génotypes pour les phénotypes de sporulation, telles que des cellules de levure transformées avec une bibliothèque de copies ou d&#39;une collection de souches de levure mutante. Dans ce cas, il faudrait les souches à vêtu d&#39;abord dans un format de 96 puits et le protocole décrit à partir d&#39;unt l&#39;étape 1.2 serait approprié.

La sporulation chez la levure en herbe a été étudié pour donner un aperçu de nombreux aspects de la biologie, y compris le contrôle de la ségrégation des chromosomes lors de la méiose 1, les mécanismes de recombinaison génétique 2, le contrôle du développement par la cellule de signalisation 3, contrôle nutritionnel du développement 4, la transcription régulation du développement 5, et l&#39;examen de la formation de spores 6. La formation de spores comprend un événement de division cellulaire nouvelle impliquant la formation de nouveaux compartiments à l&#39; intérieur de la membrane de la cellule mère , suivie par le dépôt d&#39;une paroi protectrice 6 spores. Ces études qui examinent les cellules sporulantes profitent souvent de la souche de levure sporulation rapidement SK1, qui peut subir le processus de sporulation dans environ 24 heures de façon relativement efficace 7,8. Bien que l&#39; optimisation des conditions de sporulation de la levure bourgeonnante ont été décrits 13/09, ces expériencess examiné sporulation sur des supports solides ou dans les grandes cultures liquides à grande échelle où sporulation est effectuée en utilisant des tubes de culture ou flacons. Nous décrivons ici un procédé pour la sporulation de la levure dans un format de plaque multipuits 96. Nous constatons que, pour ce procédé, l&#39;aération est essentielle pour la sporulation synchrone et efficace, et ont mis au point des techniques pour assurer une sporulation suffisante d&#39;un format multi-puits de faible volume. Sporuler dans un format de plaque multipuits 96 permet de cellules devant être criblés en utilisant des techniques à haut débit et des réactifs optimisés pour un format de plaque multipuits, un tel criblage pour des suppresseurs de copies élevé en utilisant une bibliothèque de tuiles 14-16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nunc 1.3 ml DeepWell Plates</td>
			<td style="width:123px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">260251</td>
			<td style="width:288px;">Used for sporulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nunc 2.0 ml DeepWell plates</td>
			<td style="width:123px;">ThermoScientific</td>
			<td>278743</td>
			<td>Used for presporulation growth, step 1.2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mm glass bead</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td>11-312A</td>
			<td>Used for sporulation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-511-82</td>
			<td>Used for sporulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96 well frogger</td>
			<td style="width:123px;">V&#38;P Scientific</td>
			<td style="width:119px;">VP407</td>
			<td>needed for step 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">library copier</td>
			<td style="width:123px;">V&#38;P Scientific</td>
			<td style="width:119px;">VP381</td>
			<td>needed for step 1.2; to be used with the frogger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">rectangular petri dish</td>
			<td style="width:123px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">264728</td>
			<td>needed for step 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td>needed for media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td>needed for media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">212750</td>
			<td>needed for media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D16-3</td>
			<td>needed for media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Acetate</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P171-500</td>
			<td>needed for media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>needed for media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Black 96 well glass bottom plate</td>
			<td style="width:123px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">PBK96G-1.5.5-F</td>
			<td>needed for step 2.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sporulation of saccharomyces cerevisiae in a 96 multiwell format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

<html> Pour évaluer ce protocole, l&#39; efficacité de sporulation obtenus à partir de cellules sporulantes dans des plaques multipuits (comme décrit ci - dessus) ont été comparées à des cellules sporulées en utilisant des volumes plus importants dans des flacons (tableau 2). L&#39;utilisation de plaques multipuits n&#39;a pas atteint le rendement élevé vu quand sporulation dans des flacons, où ~ 80% d&#39;efficacité peut être régulièrement vu. Sporulation dans des plaques multipuits avec une bonne aération (fournies par des billes de verre ou des barres d&#39;agitation) peut atteindre des rendements de sporulation suffisamment supérieure à 50%, avec les meilleurs résultats (66% d&#39;efficacité) obtenue en utilisant une barre d&#39;agitation x 2 mm 5 mm. Un sporulation représentant de deux souches différentes (de type sauvage et smk1Δ) est montrée ici (Figure 1). Ces cellules sont examinés après 36 h dans les médias de sporulation et visualisées en utilisant une plaque de fond 96 en verre bien. 84 / 54584fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1:. Sporulation cellules à partir d&#39; un sporulation représentant type sauvage et smk1Δ cellules 20 sporulés dans un 96 plaques multipuits. Les cellules ont été visualisées en utilisant un objectif 63X sur un microscope inversé. Tétrades réfractiles (pointes de flèche) peut être vu dans la culture de type sauvage, mais pas dans la culture contenant des cellules smk1Δ. Barre d&#39;échelle = 10 pm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54584/54584fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Sporulation a été testé en utilisant soit un 5 mm ou 7 mm barre d&#39;agitation, dont chacun correspond à l&#39; intérieur du puits de 96 1,3 ml plaque multipuits (tableau 2). En utilisant une barre d&#39;agitation 7 mm a donné lieu à l&#39;efficacité de sporulation pauvres (28%) par rapport à la plus grande efficacité (66%) obtenue en utilisant la barre d&#39;agitation de 5 mm. La barre d&#39;agitation 7 mm dans un puits a eu tendance à interagir avec une barre d&#39;agitation dans unn puits adjacent (figure 1), ce qui empêche les barres de pouvoir mélanger et fournir une aération adéquate de la culture correctement. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> les cellules sporulantes (en%) </td><td> SEM (%) </td></tr><tr><td> flacon dans un shaker </td><td> 82 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> aucune bille dans un shaker </td><td> 17 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> perle dans un shaker </td><td> 56 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> aucune barre d&#39;agitation sur la plaque d&#39;agitation </td><td> dix </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> 5 mm remuent bar sur la plaque d&#39;agitation </td><td> 66 </td><td> 3.9 </td></tr><tr><td> 7 mm remuent bar sur la plaque d&#39;agitation </td><td> 28 </td><td> 6.7 </td></tr><tr><td> SEM = erreur standard de la moyenne </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2:L&#39; efficacité de la sporulation , en utilisant des conditions différentes. Sporulation a été réalisée dans des plaques à 96 puits à puits multiples tel que décrit ci - dessus, ou, si indiqué, dans des flacons de 500 ml contenant 50 ml de milieu de sporulation. Huit puits différents ont été moyennées pour chaque condition réalisée dans une plaque multipuits. Trois flacons différents ont été sporulés. Toutes les cultures sont répétitions techniques, ont commencé à partir de la même colonie de HTB2 mCherry marqués mais le type sauvage autrement SK1 diploïde souche de levure (LH902 18). Ces cellules ont été cultivées dans un seul flacon de YPD et un seul flacon de APY, puis divisé pour inoculer des plaques à 96 puits contenant un milieu de sporulation tel que décrit ci-dessus. l&#39;efficacité de sporulation a été analysée par comptage des spores réfractiles 36 heures après le transfert aux médias de sporulation utilisant Nomarski DIC microscopie en fond clair. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54584/54584fig2.jpg" /> Figure 2: Stirbars dans 96 1,3 ml plaques multipuits. culture sporulation contenant soit (A) 5 mm x 2 mm barres d&#39;agitation (rouge) ou (B) des barres 7 mm x 2 mm d&#39;agitation (bleu) dans une plaque multipuits 96 1,3 ml sur un agitateur magnétique assiette. Barre d&#39; échelle = 10 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54584/54584fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Sporulation efficace de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Dans un 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

10.0K vues.  University of Massachusetts Boston. Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Recherche

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.