Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&amp;D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health &amp; Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).

1. Sondes d&#39;étiquetage avec digoxigénine-dUTP par PCR <ol><li> Effectuer l&#39; étiquetage PCR 10x dNTP mix contenant digoxigénine-dUTP comme décrit précédemment 13. </li><li> Purifier produit PCR avec purification spin-colonne selon les instructions du fabricant. <ol><li> Si la sonde est inférieure à 200 pb, retirer gratuitement digoxigénine-dUTP par chromatographie spin-colonne à partir du mélange de réaction plutôt que la purification spin-colonne. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des diapositives polylysine Coated Remarque: La procédure complète prend environ 2 heures. La plupart des étapes sont effectuées à température ambiante, à l&#39;exception de l&#39;étape de séchage. <ol><li> Nettoyage des diapositives <ol><li> Placer les lames dans un récipient en plastique et rincer brièvement les lames avec de l&#39;eau distillée (DW). Retirer l&#39;eau et remplir le récipient avec DW contenant 1% de nettoyant pour vitres. </li><li> Agiter les lames pendant 15 minutes à 50 tours par minute à température ambiante (TA). Laver les lames avec DW 3fois pendant 5 min chacune à la température ambiante. </li><li> Laver les lames avec 70% d&#39;éthanol pendant 15 minutes avec agitation. Jeter 70% d&#39;éthanol et de placer les diapositives sur un bloc sec à 65 ° C et l&#39;air libre pendant 15 min. </li></ol></li><li> Polylysine revêtement de lames de verre multi-puits Remarque: revêtement polylysine de lame de verre est une étape importante, car elle fournit l&#39;échantillon d&#39;adhérence tout au long de la procédure de coloration. Médiocrement lame enduite entraîne la perte de l&#39;échantillon. <ol><li> Diluer la solution polylysine stock à 0,01% (p / v) dans de l&#39;eau distillée. Ajouter 20 pi de la dilution à 0,01% (p / v) de polylysine dans les puits d&#39;une lame de verre propre. </li><li> Incuber la lame de verre pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Placer les lames sur un C bloc sec 65 ° et l&#39;air sec pendant 1 heure. </li><li> Stocker les diapositives de polylysine dans la boîte sans poussière. </li></ol></li></ol> 3. Fixation de Worms sur la lame de verre (Figure 1) <ol><li> embryons Préparation pour FISH Note: les vers de récolte avant tout til la nourriture bactérienne est consommée en regardant les milieux de croissance au microscope. Starvation réduit la production d&#39;œufs de vers adultes et augmente l&#39;éclosion des œufs. Des procédés détaillés sont décrits dans 14,15. <ol><li> Cultivez les vers dans 50 mm boîte de Pétri selon des méthodes standard 14. </li><li> Après tout la nourriture bactérienne est consommée, couper le support agar dans le quartier avec une spatule. Stériliser la spatule avant de couper pour éviter la contamination. </li><li> Mettez tout le morceau de gélose sur le 100 mm du milieu de croissance des nématodes (NGM) plaque. Tourner la pièce de gélose à l&#39;envers pour les vers pour atteindre la nourriture fraîche bactérienne. </li><li> Après 48-72 heures, de recueillir les vers avec le tampon M9. Ajouter 3 - 5 ml de tampon M9 sur la plaque NGM. tampon M9 pipette sur la surface du NGM pour laver les vers. </li><li> Recueillir le liquide avec des vers et ajouter à un tube de 15 ml. Remarque: S&#39;il y a des débris de gélose après récolte, centrifuger les vers dans une solution de saccharose à 30%. Alors que les débris sont culottées, les vers flottent surla surface. </li><li> Ajouter un tampon M9 pour compenser le volume à 15 ml. Pellet les vers par centrifugation à 300 xg pendant 3 min et éliminer la majeure partie du tampon M9. Répétez cette étape 2 fois plus. Remarque: Si les vers sont toujours flottantes après centrifugation, régler le niveau de la centrifugeuse de frein à la valeur = 1. </li><li> tampon Aspirer M9. Ajouter une solution de blanchiment pour les vers. Par 0,5 ml de vers, ajouter 6,5 ml de DW, 2 ml d&#39;hypochlorite, de 1 ml de 5 M KOH. </li><li> Incuber les vers à bascule à température ambiante pendant 3 min à 50 rpm. vers Vortex pendant 15 secondes au cisaillement mécanique des vers et exposer les oeufs. </li><li> Observer le tube sous un microscope de dissection pendant le blanchiment. Assurez-vous que les vers sont coupées en deux et les œufs sont libérés. Lorsque la plus grande partie du corps adulte est dissous, ajouter un tampon M9 pour compenser le volume à 15 ml. </li><li> Centrifuger à 300 xg pendant 3 min. Aspirer la plupart des M9 et ajouter un tampon M9 frais pour compenser le volume à 15 ml. Répétez l&#39;étape de lavage 3 fois. Remarque:Évitez d&#39;utiliser trop de vers, car elles entravent le processus de blanchiment. Maintenir le temps de réaction global inférieur à 8 min jusqu&#39;à ce que le cycle de lavage. Plus-blanchies oeufs produisent une forte autofluorescence. </li><li> Ajouter un tampon phosphate salin avec polysorbate-20 (PBST) jusqu&#39;à 200 pi et 200 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) pour faire 2% PFA. Attention: Comme PFA est cancérigène, porter des vêtements de protection, des gants et protection oculaire avant d&#39;utiliser PFA. </li><li> Ajouter 40 pi des oeufs dans 2% PFA sur le puits de polylysine enduit diapositive. </li><li> Placer les lames dans une chambre humide et incuber pendant 15 min à température ambiante. Fermez la chambre humide juste après les lames sont placées à l&#39;intérieur. Nota: Les oeufs se déposent au fond de la glissière tout en étant fixe. </li></ol></li><li> Préparation de gonades disséquées pour FISH <ol><li> vers récolte adultes cultivés sur 50 mm plaque NGM par pipetage 1 ml de tampon M9. vers récolte avant la nourriture bactérienne est épuisée. </li><li> Laver les vers de toute bactérie with tampon M9, 2 fois. Note: les bactéries résiduelles peuvent interférer avec les gonades disséquées de coller sur des lames de polylysine enduit. </li><li> Pellet les vers par centrifugation à 300 x g. Retirer M9 et transférer les vers à la plaque NGM vide par micropipette. </li><li> Ajouter 30 pi de tampon M9 contenant mM lévamisole 2 sur un puits de polylysine traitée diapositive. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon M9 à un tube de 1 ml. Utilisez ce tampon pour transférer les vers par la bouche pipette. </li><li> Remplissez la pointe de la pipette à la bouche avec un tampon M9 en plaçant un capillaire dans le tube 1 ml contenant le tampon M9. </li><li> Sous microscope disséquant, mettre la pointe de la bouche pipette juste en face de la tête du ver adulte et faites glisser la bouche pipette de sorte que la tête de vers entre dans la bouche pipette. Une fois la tête de vers entre la pointe, le corps entier du ver sera aspiré dans la pointe. </li><li> Transférer les vers à la diapositive polylysine enduit en utilisant la bouche pipette. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un rasoir, coupe def la tête ou l&#39;extrémité de la queue des vers sur la diapositive. Lorsque le ver est coupé, les gonades vont sortir. Gonads colleront aux diapositives. <ol><li> Préparer au moins 30 vers dans un puits. Plus de puits peuvent être utilisés pour un autre 30 vers. </li></ol></li><li> Mettez la lame dans la chambre humide et Aspirer le tampon M9 avec la bouche pipette. </li><li> Fixer l&#39;échantillon en ajoutant 20 ul de 2% de PFA à température ambiante pendant 15 minutes dans une chambre humide. </li></ol></li></ol> 4. Fixation et perméabilisation <ol><li> Placez un bloc d&#39;aluminium sur glace sèche et le stocker dans un congélateur (-80 ° C). méthanol de magasin et de l&#39;acétone à -20 ° C. </li><li> Après PFA fixation étape 3.1.15 ou 3.2.11, supprimer fixateur en utilisant micropipette laissant ~ 5 pi du fixateur. </li><li> Mettez une autre diapositive polylysine enduit sur la lame de l&#39;échantillon. Retirer le fixateur avec une serviette en papier, si la solution est excessive. Ne déplacez pas les diapositives une fois qu&#39;ils sont coincés ensemble. </li><li> Congeler les diapositivessur le bloc d&#39;aluminium pendant au moins 15 min. Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 2 - 3 jours. </li><li> Alors que les diapositives sont gelés, mettre les pots contenant du méthanol froid et de l&#39;acétone sur la glace. </li><li> Prenez les diapositives sur et les tordre pour geler-casser l&#39;échantillon. Jeter la lame supérieure. tremper immédiatement la lame dans le méthanol glacé pendant 5 min. </li><li> Transférer les lames à l&#39;acétone glacée pendant 5 min. </li><li> Laver les lames 3 fois avec PBST pendant 5 min pour éliminer le fixateur résiduel. Passez à l&#39;étape suivante ou stocker les diapositives dans 100% d&#39;éthanol à 4 ° C. Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 2 - 3 jours. </li></ol> 5. Hybridation de cellules fixes <ol><li> Ajouter 20 ul d&#39;une solution de RNase (PBST contenant 10 pg / ml de RNase A). Incuber la lame dans la chambre humide à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laver la lame à deux reprises dans une solution saline et 2x citrate de sodium, du polysorbate 20 (2x SSCT) pendant 15 min à chaque fois. </li><li> Ajouter 20pi de solution d&#39;hybridation et de mettre la chambre humide à 37 ° C incubateur. Après 1 heure, retirer la solution d&#39;hybridation par pipetage. </li><li> Avant de retirer la solution d&#39;hybridation, de préparer la sonde. Si la sonde est double brin d&#39;ADN, dénaturer les sondes par chauffage à 95 ° C pendant 5 minutes sur un bloc sec. Après chauffage, refroidir la sonde brièvement de la glace. </li><li> Ajouter 10 pi de solution d&#39;hybridation contenant les sondes à l&#39;échantillon. Pour la sonde de type PNA, la concentration d&#39;utilisation à un rapport de 1: 2000 et pour la sonde marquée à la DIG, la concentration d&#39;utilisation à un rapport de 1: 200. Couvrir l&#39;échantillon avec couvercle en verre. </li><li> Mettez une serviette en papier imbibé d&#39;eau sur le bloc thermique (80 ° C). Mettez un couvercle de boîte en plastique sur le bloc thermique pour conserver l&#39;humidité et de la température. </li><li> Après que la température du bloc thermique est stabilisée (à 80 ° C), placer la lame d&#39;échantillon sur la serviette en papier chauffé et couvrir les échantillons avec le couvercle de la boîte en plastique. Dénaturer l&#39;échantillon pendant 3 min. </li><li> IncUbate les lames dans une chambre humide pendant une nuit à 37 ° C. </li></ol> 6. Washes et immunofluorescence <ol><li> Réchauffer la solution de lavage d&#39;hybridation (2x SSC, formamide à 50%) à 37 ° C. </li><li> Laver l&#39;échantillon dans le PBST deux fois à température ambiante pendant 5 min. Retirez le couvercle en verre. </li><li> Laver l&#39;échantillon dans une solution de lavage d&#39;hybridation à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver la lame de l&#39;échantillon dans PBST 3 fois à la température ambiante. Remarque: Effectuez toutes les étapes ultérieures de chambre humide à température ambiante. </li><li> Ajouter 20 ul de solution de blocage et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide. </li><li> Retirer la solution de blocage et ajouter FITC solution d&#39;anticorps anti-digoxigénine conjugué (1: 200) pendant 3 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li></ol> 7. Montage et Observation <ol><li> Laver la lame d&#39;échantillon avec PBST 2 fois pendant 15 min chacune. </li><li> Ajouter 10 pi de solution de montage avec DAPI. Mettez le couvercle en verre et appuyez doucement. Retirez tout excès de solutionavec une serviette en papier. </li><li> Pour éviter l&#39;évaporation de la solution de montage, sceller les bords du verre de couverture avec le vernis à ongles. </li><li> Observer au microscope confocal. Exclure les embryons avec un bruit de fond. Focus sur un champ avec 4 - 20 noyaux. </li><li> Prendre des images selon les instructions du fabricant avec 100X objectif. Note: Excite échantillon avec 405 laser nm pour DAPI, avec 555 laser nm pour cy3, avec 488 laser nm pour FITC. </li></ol> 8. Quantification des télomères Signal Note: Quantification a été effectuée comme décrit précédemment 16. Toutes les images qui sont à comparer doivent être prises avec même réglage, y compris le temps d&#39;exposition et la source lumineuse. <ol><li> Exporter l&#39;image au format .tif. </li><li> Téléchargez et installez le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Exécuter le logiciel d&#39;analyse d&#39;image et cliquer sur le bouton d&#39;accord. </li><li> Cliquez sur le bouton ouvert. Ouvrez les images avec télomères FISH en double-cliquant sur le fichier image. </li><li> Cliquez[Modifier] - [région de traitement select], sélectionnez région d&#39;intérêt par un clic gauche et en faisant glisser. Exclure la coloration non spécifique. </li><li> Cliquez sur [mesure] - [repérer les densités optiques], sélectionnez le canal avec le signal de télomères et entrez le nom de fichier pour enregistrer les résultats dans un fichier .txt. Remarque: La colonne des résultats sont dans l&#39;ordre suivant: Fluorescence de la tache, l&#39;intensité de la tache et de la zone de la tache de fond. </li><li> Copiez les valeurs et soustraire l&#39;intensité de la tache de fond de fluorescence de la tache. Les valeurs peuvent maintenant être analysées statistiquement. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Le principal avantage de notre protocole est la simplicité de la procédure sans dommage sensible à la morphologie de la structure cellulaire. Plusieurs étapes ont été optimisés pour C. elegans FISH dans ce protocole. Les étapes essentielles pour FISH succès comprennent l&#39;étiquetage des sondes, la fixation des embryons et la pénétration. méthode de marquage digoxigénine-dUTP fournit une méthode d&#39;étiquetage facile à utiliser par PCR ou pseudo-traduction. Pour marquer la séquence cible à long, nick-translation est préféré. Dans ce cas, les sondes doivent être digérées avec une enzyme de restriction appropriée afin de faciliter la pénétration des sondes. Biotine-dUTP tag est pas recommandé car les sondes marquées à la biotine produites quantité excessive de signal de fond à partir du cytoplasme. Bien que endogène réactif de blocage de biotine sont disponibles dans le commerce, il n&#39;a pas été tentée. Ce protocole utilise des embryons isolés pour augmenter la densité des cellules pour une quantification efficace. Des noyaux de C intestinaux. elegans sont de grande taille et sont polyploïdes, qui contribuent nombre et l&#39; intensité des taches de télomères par rapport au reste des noyaux somatiques excessive. Pour cette raison, l&#39; ensemble vis sans fin ne convient pas pour la quantification des télomères en C. elegans. En revanche, les embryons sont appropriés pour l&#39;évaluation de la longueur des télomères, car ils fournissent des cellules homogènes, sans effet de polyploïdie. Ce protocole utilise 2% PFA fixateur qui a bien fonctionné pour télomères FISH. Bien que le glutaraldéhyde est rapporté pour donner un signal d&#39;arrière - plan inférieur et la fixation plus fort dans l&#39; ARN par hybridation in situ, le glutaraldéhyde a augmenté significativement 18 autofluorescence. Cet excès de base n&#39;a pas été supprimé après le traitement de borohydrure de sodium, ce qui réduit un groupe aldéhyde qui n&#39;a pas réagi. Pour cette raison, le glutaraldéhyde n&#39;a pas été utilisé. Si le rapport signal sur bruit est faible, le temps de pré-hybridation peut être prolongée à plusieurs heures pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. DansDe plus, le temps de lavage stringent peut être augmentée pour diminuer le niveau d&#39;arrière-plan. technique Coloration dans C. elegans peut être un défi pour le traitement de perméabilisation approprié. C. elegans contient exosquelette cuticule épaisse qui inhibe la pénétration des anticorps et des sondes. Procédé de coloration d&#39;anticorps traditionnelle implique le traitement de la collagénase, ce qui nécessite beaucoup de temps et le processus d&#39;optimisation. La méthode de pénétration enzymatique endommage également la morphologie des vers en échange de l&#39;efficacité de pénétration. Cryo-fissure et le traitement de méthanol et d&#39;acétone a été utilisé pour faciliter la pénétration de la sonde. Gel-fissure est simple et rapide par rapport à chitinase ou yatalase traitement 19. Déshydratation ou réhydratation des séries de méthanol ne semblent pas affecter la qualité du poisson. Ces étapes ont été simplifiées dans ce protocole. Bien qu&#39;il ait été rapporté que la proteinase K digestion était nécessaire pour l&#39;hybridation in situ d&#39; ARN19, la différence évidente n&#39;a pas été observée entre les résultats des télomères FISH avec et sans traitement protéinase K. En outre, le gel-craquage d&#39;embryons fournis une méthode facile à utiliser pour visualiser de nombreuses cellules simultanément sur un plan focal unique pour grande analyse quantitative. À l&#39;aide de sonde de type PNA, le signal de télomères a été significativement augmentée par rapport à celle obtenue avec une sonde d&#39;ADN. Cela peut être dû à l&#39;affinité de liaison plus élevée pour sa cible complémentaire et sa plus petite taille (3 à 4 par rapport à répétition repeat). sonde de type PNA marqué par fluorescence se lie également directement à sa cible, réduisant au minimum les étapes suivantes. Forte affinité maintenue dans les étapes d&#39;immunofluorescence suivantes rend le post-fixation inutile, ce qui permet d&#39;éviter le bruit de fond. Cependant, certaines limitations existent dans cette technique. La première est que la perméabilisation étape légèrement la morphologie des dommages au coût de l&#39;efficacité de pénétration de la sonde. Traitement des gonadess et d&#39;embryons avec du méthanol et l&#39;acétone déformées circularité des noyaux par rapport à un témoin non traité. Pour les expériences qui nécessitent une morphologie parfaitement conservé, la méthode de perméabilisation différente devrait être tentée. Une autre est que le signal de télomère est quantifié en unités arbitraires. Ceci est principalement dû à des variations entre les expériences indépendantes. ADN ribosomique peut être considéré comme un témoin interne pour normaliser chaque échantillon. Des méthodes plus utiles peuvent être trouvés dans la référence 20. Un protocole télomères FISH simple est décrit ici, ce qui nécessite des étapes minimales. De nombreuses étapes sont réduites pour l&#39;analyse d&#39;une grande quantité d&#39;embryons. Cependant, une autre modification peut être faite pour un signal plus fort, comme le traitement de chitinase pour la pénétration, et d&#39;autres essais innovants. En combinaison avec la méthode de culture cellulaire, de super-résolution d&#39;imagerie peut être possible. Ce protocole peut aider à découvrir le nouveau mécanisme de maintien des télomères en C. elegans.

Télomères protège les extrémités chromosomiques de fusion aberrante et la dégradation. télomères mammalien se compose de séquences répétées riches en G hexamérique, TTAGGG et les complexes shelterin. La séquence répétée télomérique du nématode est similaire à ceux des mammifères (TTAGGC). La plupart des eucaryotes utilisent télomérase pour ajouter des répétitions télomériques à leurs extrémités chromosomiques. Cependant, 10 - 15% des cellules cancéreuses utilisent télomérase mécanisme indépendant, connu sous le nom alternatif Allongement de télomères (ALT) 3. Auparavant, nous avons signalé que les répétitions des télomères et ses séquences associées, nommées comme TALT, ont été amplifiés dans les télomères des lignées mutantes télomérase qui ont survécu à la stérilité critique 2. La longueur des télomères a été mesurée par PCR quantitative ou par transfert de Southern, qui fournit la longueur moyenne des télomères totaux 4,5,6,7. Lire le nombre de répétition des télomères dans les données ensemble de séquençage du génome est également un indicateur de contenu total des télomères 8. Bien que Single télomères Longueur Analyse (STELA) pourrait fournir la longueur d&#39;un seul télomères, il ne peut pas fournir l&#39; information spatiale des télomères 9. Alors que POT-1 :: mCherry protéine rapporteur fournit l&#39;information spatiale des télomères in vivo, il ne peut pas représenter la longueur de télomères double brin, comme POT-1 est une protéine 10 de liaison d&#39; un seul brin télomère. Bien que les méthodes mentionnées ci - dessus fournissent les informations moyenne de séquences répétitives, la fluorescence dans l&#39; hybridation in situ (FISH) permet d&#39;observer la quantité et la répartition spatiale des séquences individuelles d&#39;intérêt sur ​​une échelle chromosomique. Au lieu de la purification de l&#39;ADN, les tissus ou les cellules sont fixées pour préserver les informations spatiales natif dans le poisson. Ainsi, FISH est un outil à la fois quantitative et qualitative pour l&#39;observation de séquences répétées individuelles, telles que les répétitions des télomères. Ce protocole fournit un procédé efficace pour la détection simultanée des deux télosimples et d&#39; autres répétitions basées sur des améliorations de méthodes 11,12 décrites précédemment. C. elegans larves ou adultes sont organisme multicellulaire avec des cellules hautement différenciées. L&#39;hétérogénéité des cellules empêche l&#39;analyse quantitative d&#39;un grand nombre de taches de télomères. Afin de maximiser le nombre de cellules analysées, les embryons sont isolés et se propager sur les lames de polylysine revêtues pour FISH. Par ailleurs, ce protocole peut aussi être combiné avec immunofluorescence. Comme preuve que le protocole fonctionne, nous montrons qu&#39;il est possible d&#39;observer et de quantifier deux séquences répétitives différentes. sonde d&#39;ADN contre TALT1 a été généré par PCR simple contenant digoxigénine-dUTP. Ensuite, cette sonde TALT1 et télomères sonde PNA marqué par fluorescence ont été hybridées simultanément. Par la suite, la digoxigénine a été détectée par des méthodes d&#39;immunofluorescence canoniques. Nous présentons ici les images représentatives où TALT1 colocalisés avec le télomère dans trt-1 </em&gt; survivants.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PNA probe</td>
			<td>PANAGENE</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207741910</td>
			<td>use 1:200 diluted in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11573152910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizaiton solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizaiton wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2X SSC, 50% formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>BIONEER</td>
			<td>C-9012</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H3393</td>
			<td>make 10 mg/ml for stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>67578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBS, 0.1% tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P-2287</td>
			<td>Commercial name is Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P-8920</td>
			<td>prepare fresh 0.01 % w/v solution before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra Microspin G-50</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>27-53310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SSCT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2X SSC, 0.1 % tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x digoxigenin-dUTP mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification columns</td>
			<td>Cosmo genetech</td>
			<td>CMR0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cleaner / ULTRA CLEAN</td>
			<td>Dukssan pure chemicals</td>
			<td>8AV721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well glass slide</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>96041205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>196142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>Feather</td>
			<td>blade No. 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microsope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block / aluminum block</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LBH-T03</td>
			<td>Set temperature to 80&#8451;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plastic box filled with paper towel soaked in DW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software&#160;</td>
			<td>Dr. Peter Landsdorp</td>
			<td>TFL-telo</td>
			<td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observation and quantification of telomere and repetitive sequences using fluorescence in situ hybridization (fish) with pna probes in caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Il a été précédemment rapporté que survivant ALT peut émerger de mutant télomérase déficient, trt-1 (ok410), en basse fréquence en répliquant localisée en interne &quot;Modèle d&#39;ALT &#39;(TALT) séquences pour télomères entretien 2. En utilisant la sonde PNA, nous avons été en mesure de visualiser les télomères dans les gonades disséquées (figure 2A). Le signal de télomères faible a été détectée à la fois dans trt-1 (ok410) et survivant de l&#39; ALT. Le signal a été floue chevauché seulement avec DAPI, ce qui suggère qu&#39;ils peuvent ne pas être autofluorescence. Interstitielle répétition télomérique-like (ITR) est régulièrement observée dans l&#39; essai TRF dans l&#39;étude de C. elegans télomères 4,10. Considérant une grande spécificité de la sonde PNA, ils sont susceptibles d&#39;être l&#39;ITR dispersé dans tout le génome. Le nombre de taches de télomères était d&#39; environ 9 pour pachytène noyau dans trt-1 (ok410).Dans l&#39;étude précédente, 12 foyers ont été observés par POT-1 :: protéine mCherry, qui se lie à l&#39; ADN simple brin télomérique 10. Maximum de 24 foyers par noyau a été observée dans les embryons de type sauvage 17. Le résultat suggère que la méthode de reporter mCherry est meilleur pour l&#39;expérience où le nombre de télomères doit être compté. Cependant PNA FISH est capable de détecter l&#39;ADN double brin télomère ainsi que l&#39;ADN de télomère simple brin en proportion avec la longueur des télomères. En revanche, le nombre de taches de télomères était d&#39; environ 7 survivant de ALT, qui ont fusionné chromosomes (N = 3) 2. Ce résultat est cohérent avec la prédiction que les taches de télomères seraient 6 survivant ALT. Nous avons conclu que l&#39;intensité du signal d&#39;ALT survivant était suffisante pour être observé. signal de télomères a été colocalisé avec TALT1 dans le survivant ALT, suggérant que TALT1 est utilisé comme modèle de copie pour télomères en l&#39;absence de telopolymérase (figure 3). Signal de télomères des survivants ALT a augmenté par rapport à celui des parents trt-1 (ok410) mutant, indiquant que télomères est solidement maintenue chez les survivants ALT sans télomérase (Figure 4). Le signal de la sonde de type PNA est supérieure à celle de la sonde marquée à la digoxygénine (figure 4). Conception des sondes avec PNA oligomère pourraient entraîner un signal plus fort que la digoxigénine-étiquetage. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig1.jpg" /> Figure 1:. Vue d&#39;ensemble de FISH Experiment Les œufs sont récoltés par le blanchiment des vers adultes et fixé dans 2% PFA sur une lame de polylysine revêtu. Les échantillons sont congélation fissurés et perméabilisées avec du méthanol et de l&#39;acétone pour la pénétration de la sonde. Les sondes sont ajoutés à l&#39;échantillon et hybridées pendant une nuit à 37 ° C. sonde digoxigénine marqué est détecté par immunofluorescence. Les échantillons sont imagés et ensuite quantifiéd par le logiciel d&#39;analyse d&#39;images. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig2.jpg" /> Figure 2:. Télomères FISH dans les gonades disséqués (A) télomères (rouge) a été détectée par cy3-PNA- (TTAGGC) 3 dans l&#39;extrémité distale de gonades (pointe de flèche). L&#39;intensité de la survie de l&#39; ALT est supérieure à celle de la TRT-1 (ok410). l&#39;image Z-stack a été rendue avec une projection maximale. Nuclei indiqué par la flèche blanche est soufflé-up sur le coin supérieur droit. Barre d&#39;échelle, 10 pm. (B) Nombre de places de télomères par noyau en stade pachytène a été mesurée par inspection visuelle. N = 50. Les barres d&#39;erreur, SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir</a>une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig3.jpg" /> Figure 3:. Télomères et TALT1 FISH dans le Embryons Une image représentative de télomères (rouge) et TALT1 (vert) FISH. Télomères et la sonde TALT1 ont été hybridées à des embryons simultanément. L&#39;ADN a été DAPI (bleu). Barre d&#39;échelle, 10 pm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig4.jpg" /> Figure 4:. Quantification des FISH données télomères et de l&#39; intensité de TALT1 de la figure 3 ont été quantifiés dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;image (un don du Dr. Peter Lansdorp). Chaque spot a été quantifiée avec ov de niveau de seuiler 15 pour exclure fond non spécifique. T-test a été utilisé pour évaluer la signification statistique. (* P &lt;0,001). Les barres d&#39;erreur, SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54224/54224fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

observation-quantification-telomere-repetitive-sequences-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

10.3K vues.  Seoul National University. We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT). 

Vidéo: Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Recherche

Biologie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse de microscopie du début de l&#39;embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extraction de prostaglandine et de l&#39;analyse en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.