La technique d&#39;enregistrement de bain était d&#39;abord utilisé par Fricke (1984) 8 et Beall et al. (1990) 9 pour mesurer les champs électriques générés lors de la queue-flips. La technique a ensuite été modifié et amélioré dans le laboratoire du Dr Donald Edwards (Georgia State University) par son ancien étudiant diplômé Dr Fadi Issa A. et son ex-postdoctoral associé Dr. Jens Herberholz. D&#39;autres améliorations ont été faites et des applications nouvelles recherches ont été testés dans le laboratoire du Dr. Jens Herberholz à l&#39;Université du Maryland. Je tiens à remercier mon collègue, le Dr David Yager de me laisser utiliser son système de vidéo à haute vitesse et mes assistants de recherche, David Rotstein et William Liden de l&#39;aide pour les expériences.

Partie 1: chambre d&#39;enregistrement <ol><li> La chambre d&#39;enregistrement est de forme rectangulaire et est fait de verre à parois minces. Dimensions de la chambre sont de 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (longueur x largeur x hauteur) pour les animaux de 2.5 à 3.5 cm de longueur totale (mesuré à partir de tribune pour telson). Voir Fig. 1 pour un exemple d&#39;une chambre utilisée dans nos expériences. </li><li> Alternativement, des chambres d&#39;enregistrement peuvent être faites d&#39;autres matériaux (par exemple, non-toxique en plastique transparent). Taille Chambres peuvent varier en fonction de la procédure expérimentale et les chambres doivent être personnalisées pour chaque série expérimentale. Pour de meilleurs résultats, la taille de la chambre doit être aussi petit que possible, sans retenir les animaux dans leur comportement naturel. En règle générale, les longueurs et largeur de la chambre ne doit pas être plus de trois fois la taille de l&#39;animal. </li></ol> Partie 2: électrodes de Bath et le fil de terre <ol><li> Une paire d&#39;électrodes d&#39;enregistrement et une électrode de masse sont utilisés. Les électrodes sont faites de fil de cuivre isolé (26 AWG avec 0,25 mm d&#39;isolation). Une extrémité de l&#39;électrode de bain est connecté à un amplificateur extracellulaire (AM Systems 1700; voir ci-dessous) et de 0,5 - 1,0 mm d&#39;isolation sont arraché les autres extrémités. Le fil de terre est reliée à la terre de l&#39;amplificateur ou tout autre équipement mis à la terre et de 2-3 cm d&#39;isolant est arraché l&#39;autre extrémité. </li><li> Électrodes de Bath et le fil de terre sont attachés à la paroi intérieure de la chambre d&#39;enregistrement avec la colle non toxique. Les électrodes d&#39;enregistrement sont positionnés au centre des deux côtés courts de la chambre et en face les uns aux autres (Fig. 1). </li><li> Électrode de masse est positionné sur un côté long de la perpendiculaire à la chambre d&#39;enregistrement des électrodes d&#39;enregistrement (Fig. 1). </li><li> Chambre est remplie d&#39;eau déminéralisée. Les meilleurs résultats sont obtenus avec de l&#39;eau de haute résistance (~ 18 MQ). </li></ol> Partie 3: Les enregistrements d&#39;électrode de bain <ol><li> Sorties d&#39;électrodes d&#39;enregistrement sont amplifiés (1000x) par un amplificateur extracellulaire (systèmes AM; modèle 1700). Signal provenant des électrodes d&#39;enregistrement est filtré en utilisant une combinaison de basse fréquence (&lt;100 Hz) et hautes fréquences des seuils (&gt; 5 KHz). Le signal est ensuite connecté à un commutateur et une carte d&#39;acquisition de données (National Instruments). Les données numérisées sont enregistrées, stockées et analysées à l&#39;aide du logiciel d&#39;acquisition de données (Photron Outils Motion). </li><li> Alternativement, le signal amplifié à partir d&#39;électrodes d&#39;enregistrement peuvent être numérisés à l&#39;aide d&#39;autres convertisseurs analogiques-numériques (par exemple, MDS Analytical Technologies, Digidata 1440) avant que les données numérisées sont enregistrées à l&#39;aide d&#39;autres logiciels disponibles sur le marché d&#39;acquisition de données (par exemple, MDS Analytical Technologies, Axoscope). </li></ol> Partie 4: sonde de stimulation <ol><li> Une sonde de stimulation est constitué d&#39;une pipette en verre (14 cm de longueur) équipé d&#39;une paire d&#39;électrodes à fil fin. Extrémités des électrodes sont exposés (0,2 mm) pour produire un signal électronique lorsque l&#39;animal est touché par la sonde. Cela permet de mesurer le temps exact de la stimulation. </li><li> Sorties de la sonde stimulantes sont amplifiés (1000x) par un amplificateur extracellulaire (systèmes AM; modèle 1700). Le signal est filtré en utilisant une combinaison de basse fréquence (&lt;100 Hz) et hautes fréquences des seuils (&gt; 5 KHz). Le signal est ensuite connecté à un commutateur et une carte d&#39;acquisition de données (National Instruments). Les données numérisées sont enregistrées, stockées et analysées à l&#39;aide du logiciel d&#39;acquisition de données (Photron Outils Motion). </li></ol> Partie 5: Les enregistrements vidéo <ol><li> Une caméra vidéo à haute vitesse (FastCAM-X 1280 PCI, Photron) est positionné perpendiculairement à la chambre d&#39;enregistrement pour fournir une vue de côté. Niveau de luminosité à l&#39;intérieur de la chambre d&#39;enregistrement doit être ajusté pour fournir de meilleurs résultats, par exemple en utilisant un éclairage à col de cygne ou d&#39;autres sources de lumière focalisable. </li><li> Haute vitesse vidéographie est combiné et synchronisée avec les enregistrements électroniques en utilisant un boîtier de dérivation et d&#39;acquisition de données pension (National Instruments). Signal amplifié par les électrodes de bain est relié à la boîte de dérivation et de carte d&#39;acquisition de données en utilisant des câbles BNC. Une alimentation externe main gâchette commence l&#39;acquisition vidéo et de données synchronisées. </li></ol> Partie 6: Procédure expérimentale <ol><li> Un seul animal est introduit dans la chambre et a permis de s&#39;acclimater pendant 5 minutes. Evasion queue flips sont suscités par des robinets simples d&#39;intensité différente à la tête ou l&#39;abdomen, respectivement. L&#39;intensité des robinets est contrôlé par l&#39;expérimentateur. Chaque échapper à la queue-flip est enregistré avec la vidéo haute vitesse à une cadence de points f / sec, et les données 1000 des potentiels de champ électroniques sont enregistrés à 25 kHz. Début de la baignoire et l&#39;enregistrement vidéo est initié par un interrupteur manuel sur une boîte de déclenchement. Le temps d&#39;enregistrement est déterminée par la cadence choisie (par exemple, 1000 f / sec = 4 temps sec total d&#39;enregistrement). Post-temps d&#39;enregistrement et de pré-déclenchement peuvent être sélectionnés. </li><li> None: les enregistrements d&#39;électrode de bain doit être vérifié une fois pour chacune des espèces testées en combinant des enregistrements d&#39;électrode de bain avec d&#39;autres méthodes d&#39;enregistrements disponibles. Dans les écrevisses, une paire d&#39;électrodes d&#39;argent peuvent être implantés chirurgicalement dans la corde nerveuse ventrale. Les stimuli provoquant la queue-flips d&#39;échappement peut être appliquée et a enregistré des traces électroniques d&#39;électrodes implantées et salle de bain peut être comparé. </li><li> Evasion queue-flip comportement et l&#39;activité neuronale correspondante peuvent être enregistrées dans une variété de contextes différents, par exemple, en réponse aux menaces visuelle, au cours des attaques de prédateurs, ou lors de rencontres agonistiques de deux écrevisses. Taille de la chambre, le mode d&#39;enregistrement, etc doit être ajustée en conséquence (voir discussion). </li></ol> Partie 7: Analyse des données <ol><li> Les images vidéo individuelles sont analysées en utilisant l&#39;outil logiciel de mouvement (Photron). Des traces électroniques sont utilisés pour identifier le type de circuit neuronal qui a été activé par chaque stimulus. Les données vidéo sont synchronisés par rapport aux enregistrements physiologiques pour déterminer le mouvement de l&#39;animal et le circuit neuronal activé. Chaque circuit activé produit une signature caractéristique électronique (voir résultats représentatifs). </li><li> La latence entre le contact de la sonde et la réponse neurale / musculaires sont calculées pour chaque expérience en mesurant le délai entre l&#39;apparition du signal de la sonde et l&#39;apparition du signal enregistré avec les électrodes de bain. </li></ol> Partie 8: Les résultats représentatifs Une série de simples images vidéo à haute vitesse et correspondant enregistrements champ électrique pour échapper à la queue-flip en réponse à un stimulus tactile livrée à la tête ou la queue d&#39;une écrevisse juvénile (fig. 2). Fig. 2A: Forte stimulus tactile à la tête évoquait une queue-flip commandé par le circuit médial géant. Le pic enregistré le neurone géant (astérisques) et la déviation de grandes phasique qui suit permet l&#39;identification non ambiguë de la queue-flip que médiée par l&#39;activité des neurones géants. Le mouvement en arrière montre le trace vidéo détermine l&#39;identité du circuit neuronal activé (MG). Fig. 2B: Queue-flip médiée par le circuit gigantesque latérale après un fort stimulus tactiles a été appliquée à la queue. Mouvement vers le haut et en avant vu dans la vidéo avec des traces de la trace synchronisé électronique affichant le géant pic et la grande, la déviation phasique initiale détermine l&#39;identité du circuit neuronal activé (LG). Fig. 2C: Queue-flip contrôlées par des non-géant circuits. Un stimulus tactiles plus graduelle a été livré au thorax de l&#39;animal. Alors que le mouvement capté sur vidéo ne permet pas l&#39;identification non ambiguë du circuit est activé, l&#39;enregistrement électronique manque un pic géant et se compose de beaucoup plus petites déflexions identifier le circuit activé (non-G). Fig. 3: Les mesures de latence pour les trois types d&#39;échapper à la queue-flips. Temps entre le contact de la sonde et la réponse physiologique a été mesurée pour sept animaux. Giant-médiée queue flips sont déclenchés nettement plus rapide que le géant non la queue-flips. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> Figure 1: Un exemple pour une chambre d&#39;enregistrement utilisée dans nos expériences pour les animaux de 2,5-3,5 cm de longueur totale. Les électrodes de bain sont collés sur les côtés opposés de la chambre tandis que le fil de terre est attaché au côté long de la chambre et perpendiculaire aux électrodes de bain. Figure 2: des images vidéo enregistrées à simple enregistrements f / sec et correspondant électroniques 1000 pour trois différents types de stimulation. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> A) Une forte impulsion tactiles a été livré à la tête de l&#39;animal et a suscité un géant médial (MG) ​​médiée queue-flip. Six vidéo-cadres sont affichés sur la gauche. Enregistrement à partir de traces de la sonde utilisée pour toucher l&#39;animal est affichée en gris; le point de contact est indiqué par la flèche noire. Enregistrement de traces obtenus avec des électrodes de bain est représentée en bleu. L&#39;encart montre le pic de petit géant qui précède l&#39;axone grands déplacements phasique. Les barres grises correspondent aux images de la vidéo-montre sur la gauche. Le premier mouvement notable de la queue de l&#39;écrevisse s&#39;est produite à l&#39;image n ° 3, sept millisecondes après le contact avec la sonde. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> B) Un fort stimulus tactiles a été livré à la queue de l&#39;animal et a suscité un géant latéral (LG) médiée queue-flip. Six vidéo-cadres sont affichés sur la gauche. Enregistrement à partir de traces de la sonde utilisée pour toucher l&#39;animal est affichée en gris; le point de contact est indiqué par la flèche noire. Enregistrement de traces obtenues avec leélectrodes de bain est affichée en rouge. L&#39;encart montre le pic de petit géant qui précède l&#39;axone grands déplacements phasique. Les barres grises correspondent aux images de la vidéo-montre sur la gauche. Le premier mouvement notable de la queue de l&#39;écrevisse s&#39;est produite à l&#39;image n ° 3, huit millisecondes après le contact avec la sonde. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C) Un stimulus faible et progressive tactiles a été livré à la tête de l&#39;animal et a suscité un non-géant (Non-G) médiée queue-flip. Huit vidéo-cadres sont affichés sur la gauche. Enregistrement à partir de traces de la sonde utilisée pour toucher l&#39;animal est affichée en gris; le point de contact est indiqué par la flèche noire. Enregistrement de traces obtenus avec des électrodes de bain est représentée en noir. La trace manque le potentiel gigantesque pic, les grands déplacements initiaux et se compose des potentiels d&#39;amplitude beaucoup plus petite. Barres gris clair correspondent à des images vidéo-montre sur la gauche. Le premier mouvement notable de la queue de l&#39;écrevisse s&#39;est produite à l&#39;image n ° 6, 115 millisecondes après le premier contact avec la sonde. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> Figure 3: mesures de latence de réponse pour les sept animaux différents des deux sexes et de tailles similaires (moyenne ± stdv longueurs: 3,2 cm ± 0,2 cm, mesurée à partir de tribune pour telson). MG (barre bleue) et LG (barre rouge) queue-flips ont latences de réponse significativement plus courts que la queue-flips médiée par des non-G (barre noire) circuits. Moyennes et déviations standards sont affichées. Bars avec la même lettre ne diffèrent pas significativement les unes des autres (test de Wilcoxon Rank Signé à titre de comparaison par paire, p &lt;0,05).

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	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Non-invasif des enregistrements de l&#39;activité seul neurone ou l&#39;activation des circuits neuronaux sont difficiles à obtenir chez les animaux sans retenue. La méthode décrite ici fournit un moyen d&#39;identifier des schémas d&#39;activation neuronale sous-jacente naturellement comportement. Dans le passé, nous avons utilisé avec succès cette technique pour mesurer les tendances de l&#39;activité dans les circuits neuronaux de s&#39;échapper écrevisses juvéniles lors de la formation de hiérarchies de dominance sociale 1, lors des attaques de prédateurs naturels 2, et plus récemment, en réponse aux menaces visuelle 3. Actuellement, nous utilisons des enregistrements synchronisés électrode de bain et des enregistrements vidéo haute vitesse pour mesurer l&#39;importance des mouvements d&#39;appendices tête pendant l&#39;exécution de comportements de fuite dans les écrevisses. Bien que cette technique n&#39;a été utilisée que dans deux différentes espèces d&#39;invertébrés (langoustes et les libellules) et dans deux laboratoires différents 4, il semble probable qu&#39;il puisse être appliqué à d&#39;autres systèmes de modèles animaux, y compris les vertébrés, dont certains sont des comportements aquatiques et expresse que sont contrôlés par des grands neurones. Par exemple, les réponses évacuation rapide des poissons téléostéens sont contrôlés par de nombreuses cellules de Mauthner, de grands neurones identifiables 5. Evasion comportements médiée par les cellules de Mauthner a reçu beaucoup d&#39;attention dans la littérature et a été étudié sur plusieurs niveaux d&#39;analyse, et pourtant, il ya plus de preuves que les cellules de contrôle Mauthner tourne rapides du corps dans des situations qui ne sont pas liés à s&#39;échapper 6,7. La preuve, cependant, est principalement dérivée de comparer les variables cinématiques des comportements et non pas de mesures directes de l&#39;activité des cellules de Mauthner. Il peut être possible d&#39;utiliser des enregistrements d&#39;électrode de bain en combinaison avec haute vitesse pour mesurer la vidéographie potentiels de champ généré par les cellules de Mauthner ou associés de l&#39;activité musculaire. En plus de sa valeur scientifique, la technique décrite ici est également parfaitement adapté à des fins éducatives (par exemple, des laboratoires d&#39;enseignement de premier cycle) en raison de sa simplicité globale et leur coût modique.

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

La relation entre les tendances de l&#39;activité neuronale et correspondant expression comportementale est difficile à établir chez les animaux sans retenue. Traditionnel des méthodes non invasives nécessitent des sujets de recherche, au moins partiellement restreinte, et elles ne permettent l&#39;identification d&#39;un grand nombre de neurones activés simultanément. D&#39;autre part, les petits ensembles de neurones ou de neurones individuels ne peuvent être mesurées en utilisant une seule cellule enregistrements obtenus à partir des préparations largement réduite. Depuis l&#39;expression du comportement naturel des animaux est limité sobre et disséqué, les mécanismes neuraux sous-jacents qui contrôlent un tel comportement sont difficiles à identifier. Ici, je présente une technique non invasive qui permet de mesurer physiologiques d&#39;activation des circuits neuronaux dans le comportement des animaux librement. En utilisant une paire d&#39;électrodes de fil dans une eau remplie de chambre, les électrodes d&#39;enregistrement de bain potentiels de champ neuronal et musclé généré par écrevisses juvéniles au cours des réponses échapper naturelle ou expérimentale évoquée. Les réponses échapper primaires d&#39;écrevisses sont médiés par trois types différents de la queue-flips qui déplacent les animaux à l&#39;écart du point de stimulation. Chaque type de la queue-flip est contrôlée par son propre circuit neuronal; les deux réponses échapper à la plus rapide et plus puissant nécessitent une activation de différents ensembles de neurones de commande importante. En combinaison avec les observations comportementales, les enregistrements d&#39;électrode de bain permettent l&#39;identification sans ambiguïté de ces neurones et les circuits associés neurones. Ainsi, l&#39;activité des circuits neuronaux qui sous-tendent le comportement naturel peut être mesuré chez les animaux sans retenue et dans différents contextes de comportement.

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Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Mesures non invasives de l&#39;activité neuronale dans les modèles librement comportement des animaux sont obtenues en combinant des enregistrements neurophysiologiques avec vidéographie à grande vitesse.

Enregistrements de l&#39;activation des circuits neuronaux dans les Librement Behaving Animaux

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

recordings-of-neural-circuit-activation-in-freely-behaving-animals

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K vues.  University of Maryland. Mesures non invasives de l'activité neuronale dans les modèles librement comportement des animaux sont obtenues en combinant des enregistrements neurophysiologiques avec vidéographie à grande vitesse.

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Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Cellules entières Recordings of Light évoqués courants synaptiques excitateurs dans la tranche la rétine

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Recherche

Biologie

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Les mesures de la fréquence cardiaque et ventilatoire déplaçant librement écrevisses

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Enregistrements aspiration simple cellule à partir de cônes photorécepteurs de la souris

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

Assay RhoC activation GTPase

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Modélisation des membranes biologiques avec des cartes de circuits et la mesure des signaux électriques dans les axones: Exercices de laboratoire étudiant

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

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Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

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Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

De procéder au lavage vaginal, coloration au cristal violet et l&#39;évaluation cytologique vaginal pour Souris cycle œstral Staging identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Enregistrements de l'activation des circuits neuronaux dans les Librement Behaving Animaux

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