Microscopie et coloration : Gram, Capsule et endospores.

Source: Rhiannon M. LeVeque¹, Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, et Victor J. DiRita^1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East Lansing, Michigan, États-Unis d'Amérique

Les bactéries sont diverses micro-organismes que l'on trouve presque partout sur Terre. De nombreuses propriétés aident à les distinguer les unes des autres, y compris, mais sans s'y limiter, le type, la forme et l'arrangement de Gram, la production de capsules et la formation de spores. Pour observer ces propriétés, on peut utiliser la microscopie légère; cependant, certaines caractéristiques bactériennes (par exemple la taille, le manque de coloration et les propriétés réfractives) font qu'il est difficile de distinguer les bactéries uniquement avec un microscope léger (1, 2). La coloration des bactéries est nécessaire pour distinguer les types bactériens par microscopie légère. Les deux principaux types de microscopes légers sont simples et composés. La principale différence entre eux est le nombre de lentilles utilisées pour amplifier l'objet. Les microscopes simples (par exemple une loupe) n'ont qu'une lentille pour grossir un objet, tandis que les microscopes composés ont plusieurs lentilles pour améliorer le grossissement (figure 1). Les microscopes composés ont une lentille objective près de l'objet qui recueille la lumière pour créer une image de l'objet. Ceci est ensuite amplifié par l'oculaire (lentille oculaire) qui agrandit l'image. La combinaison de la lentille objective et de l'oculaire permet un grossissement plus élevé que l'utilisation d'une seule lentille. Typiquement, les microscopes composés ont plusieurs lentilles objectives de différents pouvoirs pour permettre un grossissement différent (1, 2). Ici, nous discuterons de la visualisation des bactéries avec des taches Gram, taches Capsule, et les taches Endospore.

Figure 1 : Microscope composé typique. Les parties les plus importantes du microscope sont étiquetées.

La tache Gram, développée en 1884 par le bactériologiste danois Hans Christian Gram (1), différencie les bactéries en fonction de la composition de la paroi cellulaire (1, 2, 3, 4). En bref, un frottis bactérien est placé sur une lame de microscope, puis fixé à la chaleur pour adhérer les cellules à la diapositive et les rendre plus facilement accepter des taches (1). L'échantillon fixé à la chaleur est taché de Violet de Cristal, transformant les cellules pourpres. La glissière est rincée avec une solution d'iode, qui fixe le Violet de Cristal à la paroi cellulaire, suivie d'un décoloreur (un alcool) pour laver toute violet de cristal non fixe. Dans la dernière étape, une contre-tache, Safranin, est ajoutée aux cellules de couleur rouge (figure 2). Les bactéries Gram-positives tachent le pourpre en raison de la couche épaisse de peptidoglycan qui n'est pas facilement pénétrée par le décoloreur ; Les bactéries Gram-négatives, avec leur couche peptidoglycan plus mince et leur teneur en lipides plus élevée, se décolorent avec le décolorant et sont contre-tachées en rouge lors de l'ajout de Safranin (figure 3). La coloration Gram est utilisée pour différencier les cellules en deux types (Gram-positif et Gram-négatif) et est également utile pour distinguer la forme cellulaire (sphères ou cocci, tiges, tiges courbes et spirales) et l'arrangement (cellules simples, paires, chaînes, groupes et clusters) (1, 3) .

Figure 2 : Schéma du protocole de coloration de gram. La colonne de gauche montre comment les bactéries Gram-négatives réagissent à chaque étape du protocole. La colonne de droite montre comment les bactéries Gram-positives réagissent. On y voit également deux formes de cellules bactériennes typiques : les bacilles (ou tiges) et les cocci (ou sphères).

Figure 3 : Résultats de la coloration de Gram. Une tache de Gram d'un mélange de Staphylococcus aureus (Cocci pourpre Gram-positif) et Escherichia coli (gram-négatifs tiges rouges).

Certaines bactéries produisent une couche externe visqueuse extracellulaire appelée capsule (3, 5). Les capsules sont des structures protectrices avec diverses fonctions, y compris mais sans s'y limiter à l'adhérence aux surfaces et à d'autres bactéries, à la protection contre la dessiccation et à la protection contre la phagocytose. Les capsules sont généralement composées de polysaccharides contenant plus de 95 % d'eau, mais certaines peuvent contenir des polyalcools et des polyamines (5). En raison de leur composition la plupart du temps non-ionique et de la tendance à repousser des taches, les méthodes simples de coloration ne fonctionnent pas avec la capsule ; au lieu de cela, la coloration de capsule utilise une technique négative de coloration qui tache les cellules et l'arrière-plan, laissant la capsule comme halo clair autour des cellules (1, 3) (figure 4). La coloration de capsule implique le barbouillage d'un échantillon bactérien dans une tache acide sur une glissière de microscope. Contrairement à la coloration Gram, le frottis bactérien n'est pas fixé à la chaleur lors d'une tache capsule. La fixation de la chaleur peut perturber ou déshydrater la capsule, ce qui entraîne de faux négatifs (5). En outre, la fixation de la chaleur peut rétrécir les cellules résultant en une compensation autour de la cellule qui peut être confondue comme une capsule, conduisant à de faux positifs (3). La tache acide colore le fond de diapositive ; tout en faisant un suivi avec une tache de base, Crystal Violet, colore les cellules bactériennes elles-mêmes, laissant la capsule intacte et apparaissant comme un halo clair entre les cellules et le fond de diapositive (figure 5). Traditionnellement, l'encre de L'Inde a été utilisée comme tache acide parce que ces particules ne peuvent pas pénétrer dans la capsule. Par conséquent, ni la capsule ni la cellule n'est souillée par l'encre de l'Inde; au lieu de cela, l'arrière-plan est taché. Congo Rouge, Nigrosin, ou Eosin peut être utilisé à la place de l'encre de l'Inde. La coloration des capsules peut aider les médecins à diagnostiquer les infections bactériennes lorsqu'ils examinent les cultures à partir d'échantillons de patients et à orienter le traitement approprié des patients. Les maladies courantes causées par les bactéries encapsulées comprennent la pneumonie, la méningite et la salmonellose.

Figure 4 : Schéma du protocole de coloration des capsules. Le panneau supérieur affiche le frottis de diapositive avant toute application de tache. Le panneau du milieu montre comment la diapositive et les bactéries s'occupent de la tache primaire, Congo Red. Le panneau final montre comment la diapositive et les bactéries s'occupent de la contre-tache, Crystal Violet.

Figure 5 : Résultats de la coloration des capsules. Coloration capsule d'Acinetobacter baumannii encapsulé (dénoté avec des flèches noires) et d'Escherichia coli non encapsulé (dénoté avec des flèches blanches). Notez que l'arrière-plan est sombre et que les cellules A. baumannii sont tachées de pourpre. La capsule autour des cellules A. baumannii est évidente comme un halo, tandis que E. coli n'a pas de halo.

Dans des conditions défavorables (par exemple limitation des nutriments, températures extrêmes ou déshydratation), certaines bactéries produisent des endospores, des structures métaboliquement inactives qui résistent aux dommages physiques et chimiques (1, 2, 8, 9). Les endospores permettent à la bactérie de survivre à des conditions difficiles en protégeant le matériel génétique des cellules; une fois que les conditions sont favorables à la croissance, les spores germent et la croissance bactérienne continue. Les endospores sont difficiles à tacher avec des techniques de coloration standard parce qu'elles sont imperméables aux colorants généralement utilisés pour la coloration (1, 9). La technique couramment utilisée pour tacher les endospores est la méthode Schaeffer-Fulton (figure 6), qui utilise la tache primaire Malachite Green, une tache soluble dans l'eau qui se lie relativement faiblement au matériel cellulaire, et la chaleur, pour permettre à la tache de se briser à travers le cortex de la spore (figure 7). Ces étapes colorent les cellules de plus en plus (appelées cellules végétatives dans le contexte de la biologie de l'endospore), ainsi que les endospores et les spores libres (celles qui ne se trouvent plus dans l'ancienne enveloppe cellulaire). Les cellules végétatives sont lavées à l'eau pour enlever Malachite Green; les endospores conservent la tache due au chauffage du vert de Malachite dans la spore. Enfin, les cellules végétatives sont contre-tachées avec Safranin pour visualiser (figure 8). La coloration des endospores aide à différencier les bactéries en anciens spores et en anciens non-spore, ainsi qu'à déterminer si les spores sont présentes dans un échantillon qui, s'il est présent, pourrait entraîner une contamination bactérienne lors de la germination.

Figure 6 : Schéma du Protocole de coloration endospore. La colonne de gauche montre comment les bactéries formant des spores réagissent à chaque étape du protocole. La colonne de droite montre comment les bactéries qui ne forment pas les spores réagissent.

Figure 7 : Diagramme de la structure d'Endospore. Cellule bactérienne contenant un endospore avec les diverses structures de spores étiquetées.

Figure 8 : Résultats de la coloration des endospores. Une coloration typique des endospores de Bacillus subtilis. Les cellules végétatives (démarquées par les flèches blanches) sont tachées de rouge, tandis que les endospores (dénotées avec les flèches noires) sont teintées de vert.

1. Gram Staining

1. arrangement
   1. Portez des gants et une blouse de laboratoire non inflammable, car les colorants tacheront les mains et les vêtements.
   2. Un brûleur Bunsen est utilisé pour chauffer fixer les bactéries. Faites preuve de prudence lorsque vous travaillez avec des flammes; attacher les cheveux longs.
   3. Des réactifs à taches Gram disponibles dans le commerce seront utilisés.
   4. Nettoyez les lames de microscope avec des lingettes de laboratoire.
2. protocole
   1. Pipet 10 'L phosphate tamponné salin ou bouillon de culture sur la diapositive.
   2. Enduisez une colonie bactérienne dans le liquide pour produire une mince couche uniforme.
      Note: N'utilisez pas de cultures de plus de 24 heures, car les bactéries trop âgées pourraient avoir des changements dans leur paroi cellulaire qui affecteront les résultats de la tache Gram (1, 4).
   3. Glissade complètement sèche à l'air.
   4. Une fois séchées, la chaleur fixe les bactéries en passant glisser à travers la flamme (côté bactéries vers le haut) 4-5 fois.
      Note: Ne tenez pas la glissière dans la flamme trop longtemps ou vous pouvez déformer les cellules bactériennes (1).
   5. Travailler au-dessus de l'évier, maintenir le niveau de ladiapositive et appliquer gram's Crystal Violet pour couvrir complètement les bactéries fixées à la chaleur, laisser reposer 45 secondes.
   6. Rincer l'excès de violette de cristal en tenant la glissière à un angle et en giclant un flux d'eau doux et indirect sur la glissière et en la laissant couler sur les bactéries tachées. Ne pas gicler de l'eau directement sur les bactéries.
   7. En maintenant à nouveau le niveau de la diapositive, appliquez la solution d'iode de Gram pour couvrir complètement les bactéries tachées, laisser reposer 45 secondes.
   8. Rincer l'excès d'iode comme dans l'étape 1.2.6 ci-dessus.
   9. Tout en maintenant la glissière à un angle, ajouter quelques gouttes de Décoloreur sur la diapositive, en la laissant ruisseler sur les bactéries tachées jusqu'à ce que le ruissellement est clair; généralement, environ 5 secondes. Rincer immédiatement à l'eau comme à l'étape 1.2.6 ci-dessus.
      Note: Il s'agit d'une étape cruciale dans le protocole. Permettre au Décoloreur de ruisseler trop longtemps ou pas assez longtemps se traduira par de fausses taches de Gram (4).
   10. En maintenant à nouveau le niveau de glissement, appliquer la Safranine de Gram pour couvrir complètement les bactéries, laisser reposer 45 secondes.
   11. Rincer l'excès de Safranin comme dans l'étape 1.2.6 ci-dessus.
   12. Blot, ne frottez pas, l'excès d'eau de la diapositive à l'aide de serviettes en papier.
   13. Examiner la diapositive sur le microscope à l'aide d'une immersion à l'huile avec un objectif 100X.
3. Résultats et analyse de données
   1. Les bactéries Gram-positives tacheront le violet.
   2. Les bactéries Gram-négatives tacheront le rouge.
   3. La forme (cocci, bacilles, tiges courbes, spirales) des bactéries sera visible.
   4. L'arrangement des cellules bactériennes (cellules simples, cellules appariées, chaînes de cellules, clusters, regroupements) sera visible.

2. Staining capsule

1. arrangement
   1. Portez des gants et une blouse de laboratoire car les colorants tachent les mains et les vêtements.
   2. Pour préparer une solution de violette de cristal de 1 %, mélanger 0,25 gramme de violette de cristal avec de l'eau distillée de 25 ml jusqu'à dissolution.
   3. Pour préparer la solution Congo Red 1%, mélanger 0,25 gramme Congo Red avec 25 ml d'eau distillée jusqu'à dissolution.
   4. Nettoyez les glissières avec des lingettes de laboratoire.
2. protocole
   1. Placer 10 L Congo Red sur toboggan.
   2. À l'aide d'une pointe de pipet, enduire une colonie bactérienne dans le colorant pour produire une fine couche uniforme.
   3. Glissez complètement sèche à l'air avec mélange de colorant/cellule, 5-7 minutes.
      Note: Ne chauffez pas la correction car le chauffage peut déshydrater ou déformer la capsule.
   4. Inonder le frottis de 1% de violette de cristal pendant 1 minute.
   5. Rincer la tache excédentaire en maintenant la glissière à un angle et en giclant un flux d'eau doux et indirect sur la glissière et en la laissant couler sur les bactéries tachées. Ne pas gicler de l'eau directement sur les bactéries.
   6. Maintenez la glissière à un angle de 45 degrés jusqu'à ce qu'elle soit complètement séchée à l'air.
   7. Examiner le frottis sur le microscope sous immersion à l'huile avec un objectif 100X.
3. Résultats et analyse de données
   1. Les cellules bactériennes tacheront le violet.
   2. L'arrière-plan de la glissière tachera l'obscurité.
   3. Les capsules seront un halo clair autour des cellules sur un fond sombre.

3. Staining Endospore (méthode Schaeffer-Fulton)

1. arrangement
   1. Portez des gants et des blouses de laboratoire non inflammables pour protéger les mains et les vêtements contre les colorants et les flammes.
   2. Un brûleur Bunsen est utilisé pour chauffer fixer les bactéries. Faites preuve de prudence lorsque vous travaillez avec des flammes; attacher les cheveux longs.
   3. Pour préparer 0,5% Malachite Solution verte, mélanger 0,125 grammes Malachite Green avec 25 ml d'eau distillée jusqu'à dissolution.
   4. Utilisez la solution de réactif Safranin de Gram disponible dans le commerce.
   5. Nettoyez les glissières avec des lingettes de laboratoire.
2. protocole
   1. Pipet 10 'l phosphate tamponné salline (PBS) ou bouillon de culture sur la diapositive.
   2. En utilisant la technique aseptique, enduire une colonie bactérienne dans le liquide pour produire une mince couche uniforme.
      Note: Les endospores ne se forment généralement pas dans les jeunes cellules, donc la culture est recommandée pour être entre 18 et 36 heures (9).
   3. Glissade complètement sèche à l'air.
   4. Fixer la chaleur en passant la glissière (côté bactéries vers le haut) à travers la flamme 4-5 fois.
   5. Pour aider à contenir le colorant, placez un morceau de papier de lentille (coupé pour s'adapter au frottis bactérien) au-dessus du frottis fixe de chaleur.
   6. Saturate papier d'objectif avec la solution vert de Malachite.
   7. Placez la glissière sur le dessus du bécher d'eau bouillante sur une plaque chaude, et la glissière à vapeur pendant 5 minutes, en gardant le papier de lentille humide en ajoutant plus de colorant une goutte à la fois au besoin.
      Note: Évitez la surchauffe et le dessèchement de la solution de colorant.
   8. Retirer la glissière du bécher, retirer et jeter le papier de lentille, laisser refroidir la glissière 2 minutes.
   9. Tenir la glissière à un angle, rincer soigneusement en giclant un flux d'eau doux et indirect sur la glissière, ce qui lui permet de s'écouler sur le frottis.
   10. Maintenir le niveau de la glissade, le frottis d'inondation avec Safranin, laisser reposer 1 minute.
   11. Rincer à l'excès de Safranin comme dans l'étape 3.2.9 ci-dessus.
   12. Laisser sécher à l'air.
   13. Examiner la diapositive au microscope sous immersion à l'huile avec un objectif 100X.
3. Résultats et analyse de données
   1. Les spores tacheront le vert.
   2. Les cellules végétatives tacheront en rouge.
   3. Certaines cellules végétatives contiennent des spores; les cellules tacheront en rouge, tandis que les endospores tacheront vert.

Les bactéries ont des caractéristiques distinctives qui peuvent faciliter leur identification. Certaines de ces caractéristiques peuvent être observées par la coloration et la microscopie légère. Trois techniques de coloration utiles pour observer ces caractéristiques sont Gram coloration, coloration Capsule, et Endospore coloration. Chaque technique identifie différentes caractéristiques des bactéries et peut être utilisée pour aider les médecins à recommander des traitements pour les patients, à identifier les contaminants potentiels dans les échantillons ou les produits alimentaires, et à vérifier la stérilité de l'échantillon.