Transfection d’un clone moléculaire de l’ADNr de Naegleria gruberi en trophozoïtes de N. gruberi

Ce protocole décrit une méthodologie pour transfecter les trophozoïtes de Naegleria gruberi avec une construction qui est maintenue tout au long du passage des trophozoïtes in vitro, ainsi que par l’enkystement et l’exkystement.

Tous les gènes ribosomiques de Naegleria trophozoites sont maintenus dans un élément contenant de l’ADN ribosomique extrachromosomique (ADNr) (CERE) circulaire et fermé. Bien que l’on sache peu de choses sur le CERE, une analyse complète de la séquence génomique de trois espèces de Naegleria démontre clairement qu’il n’y a pas de cistrons d’ADNr dans le génome nucléaire. De plus, une seule origine de réplication de l’ADN a été cartographiée chez N. gruberi CERE, soutenant l’hypothèse selon laquelle CERE se réplique indépendamment du génome nucléaire. Cette caractéristique de l’EREC suggère qu’il pourrait être possible d’utiliser l’ERE modifié pour introduire des protéines étrangères dans Naegleria trophozoites. Comme première étape dans l’exploration de l’utilisation d’un CERE comme vecteur chez Naegleria, nous avons développé un protocole pour transfecter N. gruberi avec un clone moléculaire du CERE de N. gruberi cloné en pGEM7zf+ (pGRUB). Après la transfection, pGRUB a été facilement détecté dans les trophozoïtes de N. gruberi pendant au moins sept passages, ainsi que par enkystement et exkystique. Comme contrôle, les trophozoïtes ont été transfectés avec le vecteur squelette, pGEM7zf+, sans les séquences de N. gruberi (pGEM). Le pGEM n’a pas été détecté après le premier passage suivant la transfection dans N. gruberi, ce qui indique son incapacité à se répliquer dans un organisme eucaryote. Ces études décrivent un protocole de transfection pour les trophozoïtes de Naegleria et démontrent que la séquence plasmidique bactérienne dans pGRUB n’inhibe pas la transfection et la réplication réussies du clone CERE transfecté. De plus, ce protocole de transfection sera essentiel pour comprendre la séquence minimale du CERE qui pilote sa réplication dans les trophozoïtes, ainsi que pour identifier les régions régulatrices dans la séquence non ribosomique (NRS).

Le genre Naegleria contient plus de 45 espèces, bien qu’il soit peu probable que tous les membres de l’espèce aient été identifiés¹. Naegleria peut exister sous différentes formes : sous forme de trophozoïtes (amibes), de flagellés ou, lorsque les ressources sont sévèrement limitées, sous forme de kystes 1,2,3,4. Le genre Naegleria est reconnu pour sa seule espèce particulièrement dangereuse, Naegleria fowleri, connue sous le nom d'«amibe mangeuse de cerveau » (examinée dans ^{1,2,3,4,5,6,7}), qui est la cause de la méningo-encéphalite amibienne primaire presque universellement mortelle.

Naegleria code leur ADNr sur le CERE situé dans le nucléole. Le séquençage complet des génomes de trois espèces de Naegleria confirme l’absence d’ADNr dans le génome nucléaire 8,9,10,11. D’après les séquences CERE complètes limitées, la CERE varie d’environ 10 kbp à 18 kbp de longueur. Les CERE de chaque espèce de Naegleria portent un seul cistron d’ADNr (contenant l’ADN ribosomique 5.8, 18 et 28S) sur chacune des 4 000 CERE par cellule 12,13,14. Outre l’ADNr, chaque CERE possède une grande séquence non ADNr (NRS). La taille des CERE varie d’une espèce à l’autre ; les différences sont principalement dues à la longueur variable du NRS, car les séquences d’ADNr sont hautement conservées dans le genre 1,15,16,17,18,19,20. La cartographie d’une origine unique de réplication de l’ADN au sein de N. gruberi CERE NRS²¹ fournit un soutien solide à l’hypothèse selon laquelle Naegleria CERE se réplique indépendamment du génome nucléaire.

N. gruberi est une amibe non pathogène souvent utilisée pour étudier la biologie de Naegleria . Nous avons développé une méthodologie pour transformer les trophozoïtes de N. gruberi avec un clone de CERE de la même espèce afin de tester l’hypothèse selon laquelle les amibes Naegleria tolèrent et répliquent indépendamment les CERE au sein des trophozoites. Cela a été accompli en transformant N. gruberi avec un clone complet de N. gruberi CERE en trophozoïtes et en suivant le destin du clone CERE donneur par réaction en chaîne par polymérase (PCR). La figure 1 donne un aperçu général du protocole. Les données présentées ici démontrent que le clone donneur peut être détecté par au moins sept passages en culture tissulaire, ainsi que par l’enkystement et l’exkystement. Ces études constituent la base d’un moyen de disséquer la réplication de CERE, ainsi que d’explorer son utilisation comme vecteur de transfection de Naegleria.

Les détails des espèces, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux. La séquence de la construction pGRUB de 17 004 paires de bases est fournie dans le fichier supplémentaire 1.

1. Cultiver des trophozoïtes

1. Décongeler les trophozoïtes de N. gruberi congelés à 37 °C pendant 3 min.
2. Inoculer des trophozoïtes dans des flacons T25 dans de la peptone/extrait de levure/acide nucléique/acide folique/hémine modifiés avec 10 % de sérum de veau fœtal (PYNFH) et un tampon à 2 % (phosphate disodique, dihydrogénophosphate de potassium).
3. Cultivez les trophozoïtes à 25 °C jusqu’à ~80 % de confluent, où ils présentent une morphologie amiboïde (Figure 2A).
   REMARQUE : Lors de la réanimation initiale d’une culture de trophozoïtes à partir de leur état gelé, cela peut prendre jusqu’à 5 à 7 jours pour qu’un T25 devienne confluent. Décanter le support tous les 3-4 jours et le remplacer par un support frais.
4. Placez les flacons confluents sur de la glace pendant 5 à 10 minutes pour libérer les trophozoïtes collés du plastique. Agitez doucement le ballon pour déloger les cellules adhérentes restantes. Les trophozoïtes ont maintenant une morphologie « arrondie » (Figure 2B).
5. Divisez les cultures de 1:2 à 1:4 dans de nouveaux flacons de culture tissulaire.
6. Retirez le PYNFH et remplacez-le par un milieu d’enkystement stérile (120 mM de chlorure de sodium, 0,03 mM de chlorure de magnésium, 1 mM de phosphate disodique, 1 mM de dihydrogénophosphate de potassium, 0,03 mM de chlorure de calcium, 0,02 mM de chlorure de fer, pH 6,8)²² pour enkyster N . gruberi.
   REMARQUE : La majorité des trophozoïtes deviennent enkystés au bout de 72 h (figure 2C). L’exkyste doit être terminé dans les 72 heures.
7. Retirer les kystes des flacons, centrifuger à 600 x g pendant 10 min à 20 °C et remettre les kystes en suspension dans un milieu PYNFH avec 10 % de sérum de veau fœtal pour exkyster les cellules. Incuber à 25 °C pendant 24 h jusqu’à ce que les trophozoïtes commencent à émerger.

2. Transfection des trophozoïtes

1. Déposer les trophozoïtes dans une plaque de culture tissulaire à fond plat à 6 puits (1 mL de 1 x 10⁶ trophozoites/mL) et cultiver à 25 °C.
2. Transfectez les cellules lorsqu’elles atteignent 70 % à 80 % de confluent (~10,4 x 10⁴ cellules/cm² en grappes de 6 puits). Réchauffez le réactif de transfection à température ambiante avant utilisation.
3. Préparez le mélange de réactif plasmide-transfection comme suit : 75 ng d’ADN plasmidique et 0,225 μL de réactif de transfection dans 200 μL de milieu PYNFH sans FBS. Préparez un mélange suffisant de réactifs de transfection plasmidique pour effectuer la transfection en double.
   REMARQUE : Un plasmide bactérien contenant un clone complet de N. gruberi CERE (pGRUB) a été utilisé dans cette étude. Un plasmide vide (pGEM) a été utilisé comme témoin négatif (Figure 3).
4. Incuber le mélange de réactif plasmide-transfection à température ambiante pendant 10 min.
5. Retirer ~800 μL de milieu des monocouches de trophozoïtes juste avant la transfection.
6. Mettez le mélange de réactifs de transfection plasmidique sur les trophozoïtes.
7. Tournez doucement la plaque toutes les 15 minutes pour éviter que le média ne s’agrège sur les bords de la plaque.
8. Laver une fois les monocouches avec 2 mL de milieu de croissance après 1 h d’incubation à 25 ^°C.
9. Traitez les monocouches avec 10 U DNase dans 1 mL de tampon 10x DNase pendant 15 min à 37 °C pour éliminer l’ADN plasmidique résiduel, lavez une fois avec un milieu de croissance, ajoutez 2 mL de milieu frais et placez à 25 °C. Incuber la plaque pendant 24-36 h.
10. Placez la plaque sur de la glace pendant 10 min pour libérer les cellules.
11. Divisez un puits (1:2) en deux nouveaux puits.
12. Recueillir des trophozoïtes des puits restants à des fins expérimentales.
    REMARQUE : Toutes les cultures sont effectuées en double. Pour chaque condition, 1 puits est utilisé pour le passage et 1 est utilisé pour l’isolation CERE.

3. Isoler CERE de Naegleria

1. Calculer le nombre de trophozoïtes dans chaque puits utilisé pour l’isolement de l’ERE par coloration d’exclusion au bleu de trypan et à l’aide d’un hémocytomètre²³.
2. Placez les trophozoïtes dans un tube de 2,0 ml.
3. Laver les trophozoïtes une fois dans 100 mM de chlorure de sodium (pH 7,5) par centrifugation (600 x g, 10 min, 4 °C).
   REMARQUE : Le chlorure de sodium empêche les trophozoïtes d’adhérer aux côtés du tube.
4. Retirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 100 μL de 100 mM d’EDTA (pH 7,5).
5. Placez le tube dans un bloc chauffant pendant 15 min à 98 °C pour lyser les cellules et inactiver les enzymes dans les trophozoites.
   REMARQUE : Cette étape inactive les DNases, qui sont abondantes dans Naegleria trophozoites. Les DNases peuvent interférer avec la capacité de détecter le CERE natif et le clone moléculaire à l’étape 4. Le rendement en ADN est diminué lorsque plus de ~3 x 10⁶ cellules sont utilisées à l’étape 3.4.
6. Centrifugez les tubes à vitesse maximale (16 000 x g) à 4 °C pendant 10 min pour granuler les débris.
7. Transférez les surnageants dans un nouveau tube.
8. L’éthanol précipite les surnageants avec 0,5 volume d’acétate d’ammonium 7,5 M (pH 7,5), 3 volumes d’éthanol absolu et 1 μL de glycogène à 10 mg/mL comme support.
9. Retournez le tube plusieurs fois et placez-le à -80 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit.
10. Réchauffez les échantillons à température ambiante.
11. Centrifugez les tubes à température ambiante pendant 10 min à 16 000 x g.
12. Retirer le surnageant et laver la pastille avec de l’éthanol à 70 % par centrifugation pendant 5 min à 16 000 x g (à température ambiante).
13. Retirez l’éthanol et faites sécher la pastille à l’air libre pendant 5 min.
14. Remettre en suspension la pastille séchée dans de l’eau désionisée stérile (DI). Normaliser le volume à 10 000 trophozoïtes par μL.
15. Conserver à -80 °C jusqu’à l’utilisation en PCR.

4. Détection par PCR de trophozoïtes transformés

1. Utilisez 20 000 équivalents cellulaires d’ADN, des amorces de 600 nM (tableau 1) et de la polymérase Taq et effectuez la PCR²⁴.
   REMARQUE : Les amorces qui font la distinction entre le CERE natif et le CERE cloné sont répertoriées dans le Tableau 1, tout comme les conditions de PCR. La figure 3 montre l’emplacement des amorces sur les constructions. La PCR devra être optimisée en fonction des amorces utilisées ainsi que du mélange spécifique de PCR utilisé.
2. Micro-ondes 0,8 % d’agarose dans 1 base Tris, acide acétique et tampon EDTA (TAE) jusqu’à ce que l’agarose soit dissoute.
3. Refroidissez l’agarose à ~50 °C à température ambiante.
4. Versez la solution dans un plateau de coulée de gel contenant un peigne pour former des puits.
5. Laissez le gel reposer à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit solidifié.
6. Placez le gel dans l’appareil d’électrophorèse.
7. Décanter 1x TAE dans la chambre d’électrophorèse jusqu’à ce que le gel soit recouvert.
8. Retirez le peigne.
9. Ajoutez 6 fois le colorant de chargement (0,25 % de bleu de bromphénol, 0,25 % de cyanol, 30 % de glycérol) aux échantillons et chargez le gel. Utilisez une échelle d’ADN pour déterminer la taille du produit de PCR.
10. Fixez l’électrode, allumez l’alimentation électrique et faites fonctionner le gel à 80 V pendant ~1,5-2 h.
11. Coupez l’alimentation et retirez le gel.
12. Teindre le gel avec un colorant à ADN (p. ex., 10 μL de bromure d’éthidium à 10 mg/mL) dans 100 mL d’eau DI pendant 10 min.
13. Décolorez le gel pendant 20 min dans de l’eau DI.
14. Visualisez le gel sur un système de lumière ultraviolette (UV) et documentez les résultats.

La PCR des trophozoïtes qui ont été transfectés avec pGRUB démontre que le CERE transfecté est détecté par au moins sept passages des trophozoïtes, ainsi que par l’enkystement et l’exkyste (Figure 4). Les amorces utilisées dans le recuit de la PCR s’appliquent à la fois au vecteur pGEM et à la séquence CERE, garantissant ainsi que la PCR ne détecte pas les CERE natifs. La PCR après transfection du pGEM en trophozoïtes a indiqué que le pGEM était négatif (Figure 4), indiquant que le plasmide vide n’était pas retenu par les amibes. La figure 4 montre que le pGEM a été perdu lors du premier passage - les passages suivants, l’enkystement et l’exkystement étaient tous négatifs.

Figure 1 : Organigramme de la procédure de transfection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Trophozoïtes de N. gruberi (souche NEG-M) en culture. (A) Dans des conditions de culture standard à 25 °C, les trophozoïtes de N. gruberi sont de morphologie amiboïde et adhèrent aux flacons/plaques de culture. La flèche indique un pseudopode qui est utilisé pour propulser le trophozoïte dans la direction. (B) Après l’incubation de la culture de N. gruberi sur glace, les trophozoïtes deviennent ronds en morphologie et non adhérents. (C) Après une incubation dans un milieu enkystique pendant 24 à 48 h, les trophozoïtes de N. gruberi deviennent enkystés. Barres d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Construction pGRUB utilisée pour transfecter N. gruberi (NEG-M). L’unité CERE pleine longueur de N. gruberi (souche EBM, 14 007 pb ; rouge) a été clonée en pGEM7Zf(+) (2 997 pb ; vert), ce qui a donné une construction de 17 004 pb. Les flèches sur chaque plasmide indiquent l’emplacement des amorces de PCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résultats de la PCR détectant des trophozoites de pGRUB et de pGEM transfectés dans les trophozoïtes de N. gruberi. La PCR démontre que pGRUB est détecté dans les trophozoïtes transfectés par au moins sept passages, l’enkystement (En) et l’exkystement (Ex). Le pGEM est perdu après le premier passage des trophozoïtes. P1 = passage 1, P7 = passage 7. Les témoins négatifs (neg) n’ont reçu aucun ADN dans la PCR, tandis que les témoins positifs (pos) sont soit pGRUB, soit pGEM entrés dans la PCR. Les tailles de produit attendues sont de 656 pb (pGRUB) et 337 pb (pGEM). Les figures à gauche du panneau A indiquent la taille des bandes les plus brillantes de l’échelle d’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Amorces et conditions de PCR utilisées dans ces études.

Fichier supplémentaire 1 : La séquence de la construction pGRUB de 17 004 paires de bases. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Le protocole décrit ici est très simple, bien que chaque construction nécessitera probablement un certain degré d’optimisation, en particulier du rapport ADN-réactif de transfection, en fonction de la nature de la construction et de l’espèce de Naegleria utilisée. Nous n’avons testé qu’un seul réactif de transfection disponible dans le commerce en utilisant ce protocole, mais il est probable que plusieurs autres puissent être efficaces. Étant donné qu’un clone complet de la CERE est utilisé, contenant une origine fonctionnelle de réplication et se répliquant donc de manière autonome, la construction possède toute la machinerie de réplication eucaryote nécessaire. Si un clone partiel devait être inséré dans le vecteur pGEM, on prédirait que le clone transfecté serait perdu très peu de temps après la transfection s’il ne contient pas d’origine eucaryote fonctionnelle de réplication, similaire au vecteur pGEM vide (Figure 2B). De plus, ces données démontrent que la présence d’ADN procaryote n’interfère pas avec la capacité du clone moléculaire à être retenu par le trophozoïte.

Bien qu’il y ait eu un cas signalé de transfection de trophozoïtes²⁵ de N. gruberi, l’insert utilisé dans la présente étude est considérablement plus grand (~17 kbp) que celui qui a été transfecté dans l’étude précédente (<1 kbp). Bien que l’on ne sache pas quelle est la taille maximale du plasmide toléré par les Naegleria, des données non publiées de notre laboratoire ont déterminé que les amibes d’un autre genre (Willaertia) contiennent des CERE d’une taille d’environ 24 kbp.

L’étape de traitement de la DNase (étape 2.9), qui permet de s’assurer que ce protocole détecte l’ADN dans le trophozoïte, est l’élimination de l’ADN résiduel (c’est-à-dire de l’ADN qui n’a pas été transfecté) des cultures. Quelques procédures de contrôle de la qualité ont été effectuées pour assurer l’intégrité du protocole. Tout d’abord, les constructions ont été séquencées. Deuxièmement, les produits PCR ont également été séquencés pour confirmer leur identité et s’assurer qu’il n’y avait pas de contamination de l’essai et pour confirmer que les produits PCR n’étaient pas le résultat d’une erreur d’amorçage.

Bien que la transfection réussie d’un plasmide avec une origine eucaryote de réplication ait été démontrée, il est clair à partir de la figure 4 qu’il y a une diminution du signal PCR après le premier passage des trophozoïtes. La qPCR a été réalisée sur les trophozoïtes transfectés au fil du temps, et il a été déterminé que le niveau de pGRUB chute d’environ 1 600 copies dans le passage 1 à 35 dans le passage 7 (données non présentées), indiquant que le plasmide transfecté sera probablement perdu dans les prochains passages. Ce n’est pas surprenant, car le plasmide transfecté est étranger aux trophozoïtes et serait considéré comme inutile ou préjudiciable à la survie de l’amibe.

Il y a un manque fondamental de connaissances concernant le CERE de la Naegleria. La majorité des séquences CERE de GenBank sont des séquences partielles, l’accent étant mis sur l’ADNr et les régions de l’espaceur transcrit interne (ITS), qui sont utilisées pour identifier le genre (ITS1) et l’espèce (ITS2)^1,26,27. Alors que la séquence des sous-unités de l’ADNr est très conservée entre Naegleria sp., le NRS de Naegleria sp. varie considérablement, à la fois en taille et en séquence, allant d’environ 5,5 kbp à 10 kbp 1,15,16,17,18,19,20. La fonction du NRS à Naegleria est un territoire largement inexploré, mais on présume qu’il contient des éléments régulateurs, y compris, mais sans s’y limiter, une origine de réplication, un promoteur et une séquence de terminaison¹⁷. Sur la base des séquences CERE complètes dans GenBank, une caractéristique commune de Naegleria CERE est la présence de régions répétées dans le NRS qui sont riches en A-T. La fonction de ces régions est actuellement inconnue.

La capacité de transfecter les trophozoïtes de Naegleria permet d’étudier plusieurs aspects de la biologie de CERE NRS, en particulier la dynamique et les exigences de la réplication de CERE. Chez Escherichia coli, des G-quadruplexes ont été identifiés dans les régions promotrices de certains gènes²⁸. Des structures G-quadruplex ont également été identifiées chez les promoteurs d’une grande variété d’eucaryotes, y compris les souris, les rats, les humains et les primates non humains²⁹. L’analyse in silico de plusieurs séquences CERE complètes différentes démontre que plusieurs zones du NRS sont prédites pour former des structures G-quadruplex. Une zone de structures quadruplex G prédites dans le NRS de plusieurs Naegleria sp. se trouve en amont du début du gène 18S. La capacité de transfecter des trophozoïtes permettrait d’explorer l’identification de la région promotrice de l’ADNr dans l’ÉRE de Naegleria en supprimant/mutant les séquences en amont de l’ADNr. De même, des études similaires pourraient être réalisées pour identifier les séquences qui terminent la transcription de l’ADNr.

La conservation de l’ensemble de la CERE dans les trophozoïtes pour un certain nombre de passages permettra de mener des études axées sur l’identification de la zone minimale du NRS nécessaire à la réplication du CERE. Bien qu’une région de l’ERE ait été identifiée comme l’origine présumée de la réplication²⁰, on ne sait pas si des structures secondaires à l’extérieur de la région sont nécessaires pour la réplication de l’ERRE ou si la région pourrait être considérablement tronquée et les ori rester fonctionnels. Les éléments répétitifs dans le NRS se retrouvent chez toutes les espèces de Naegleria séquencées à ce jour^{15, 16, 17, 18, 19, 20}. Le but de ces séquences est actuellement inconnu. On ne sait pas encore s’ils existent en tant qu’élément régulateur ou s’ils sont supprimés, le CERE se répliquera dans les trophozoïtes. Les séquences répétitives sont spécifiques à l’espèce chez Naegleria, mais on ne sait pas si les séquences d’une espèce peuvent fonctionner chez une autre. En bref, il y a une myriade de questions concernant la biologie de l’ECRE qui peuvent maintenant être abordées à l’aide de la technique décrite ici.

Aucun conflit d’intérêts financier n’a été déclaré.

Ces études ont été partiellement financées par une subvention du Fonds George F. Haddix de l’Université Creighton (KMD). La figure 1 est générée dans biorender.com et la figure 3 est générée dans benchling.com.