Microscopie photoacoustique ultraviolette à grande vitesse pour l’imagerie histologique avec coloration virtuelle assistée par apprentissage profond

Un microscope photoacoustique ultraviolet à grande vitesse et à toit ouvert capable de fournir des images histologiques en peropératoire pour l’analyse chirurgicale des marges est démontré, y compris la configuration du système, l’alignement optique, la préparation des échantillons et les procédures expérimentales.

L’analyse de marge chirurgicale (SMA), une procédure essentielle pour confirmer l’excision complète du tissu cancéreux en chirurgie de résection tumorale, nécessite des outils de diagnostic peropératoire pour éviter les chirurgies répétées en raison d’une marge chirurgicale positive. Récemment, en tirant parti de la haute absorption optique intrinsèque de l’ADN / ARN à une longueur d’onde de 266 nm, la microscopie photoacoustique ultraviolette (UV-PAM) a été développée pour fournir des images histologiques à haute résolution sans marquage, ce qui montre de grandes promesses en tant qu’outil peropératoire pour la SMA. Pour permettre le développement d’UV-PAM pour SMA, un système UV-PAM à grande vitesse et à toit ouvert est présenté, qui peut être utilisé de la même manière que les microscopies optiques conventionnelles. Le système UV-PAM offre une résolution latérale élevée de 1,2 μm et une vitesse d’imagerie élevée de 55 kHz avec un balayage du miroir galvanométrique à un axe. De plus, pour s’assurer que les images UV-PAM peuvent être facilement interprétées par les pathologistes sans formation supplémentaire, les images UV-PAM originales en niveaux de gris sont virtuellement colorées par un algorithme d’apprentissage en profondeur pour imiter les images standard colorées à l’hématoxyline et à l’éosine, permettant une analyse histologique sans formation. L’imagerie des tranches cérébrales de souris est réalisée pour démontrer les hautes performances du système UV-PAM à toit ouvert, illustrant son grand potentiel pour les applications SMA.

L’analyse chirurgicale de la marge (AMS), qui nécessite un examen des échantillons de tissus au microscope, est une procédure essentielle pour déterminer si toutes les cellules cancéreuses sont retirées du corps d’un patient lors d’une chirurgie de résection¹. Par conséquent, un microscope capable de fournir rapidement des images histologiques est d’une importance vitale pour la SMA afin d’éviter les chirurgies répétées causées par l’ablation incomplète des cellules cancéreuses. Cependant, selon la méthode actuelle de référence basée sur la microscopie optique à champ lumineux, le tissu excisé doit être fixé dans du formol, incorporé dans de la paraffine, sectionné en fines tranches (4-7 μm), puis coloré par l’hématoxyline et l’éosine (H & E) avant l’imagerie, ce qui prend du temps (3-7 jours) et est laborieux ^2,3 . Une section congelée est une alternative rapide à la SMA en congelant, tranchant et colorant rapidement le tissu, ce qui peut fournir des images histologiques en 20-30 min⁴. Cependant, les caractéristiques histologiques sont souvent déformées et nécessitent une formation habile, ce qui entrave l’applicabilité de la technique à plusieurs types d’organes⁵.

Des techniques de microscopie optique capables de fournir des images cellulaires sans ou avec quelques étapes de traitement des tissus ont été développées pour la SMA. Cependant, chacun d’eux souffre de problèmes différents. Par exemple, la tomographie par cohérence optique⁶ et la microscopie à réflectance confocale⁷ souffrent d’une faible spécificité en raison de leur faible contraste de diffusion intrinsèque. Bien que la microscopie avec excitation de surface ultraviolette⁸ et la microscopie à feuille de lumière⁹ puissent fournir des images à haute résolution et à contraste élevé pour la SMA, la procédure de coloration toxique et volatile ne peut généralement pas être effectuée dans une salle d’opération, ce qui prolonge le délai d’exécution. La microscopie multiphotonique¹⁰ et la microscopie Raman stimulée¹¹ peuvent fournir des informations riches pour la SMA. Pourtant, le coût élevé des lasers ultrarapides requis qui sont utilisés pour générer des effets non linéaires empêche leur large applicabilité.

Récemment, en tirant parti de l’absorption optique intrinsèque, la microscopie photoacoustique ultraviolette sans étiquette (UV-PAM) a été développée pour fournir des images histologiques à haute résolution¹². Dans l’UV-PAM, l’énergie photonique de la lumière UV d’excitation (par exemple, 266 nm) est d’abord absorbée par l’ADN/ARN dans les noyaux cellulaires¹³ , puis convertie en chaleur, induisant l’émission d’ondes acoustiques par expansion thermo-élastique¹⁴. En détectant les ondes acoustiques générées, des images UV-PAM bidimensionnelles (2D) des noyaux cellulaires peuvent être obtenues via une projection d’amplitude maximale des signaux acoustiques, fournissant des informations histologiques pour la SMA. Pour permettre les applications cliniques de l’UV-PAM, un UV-PAM à grande vitesse basé sur le balayage du miroir galvanométrique a été développé pour fournir des images histologiques pour un échantillon de biopsie cérébrale (5 mm x 5 mm) en 18 min, montrant un grand potentiel dans les applications sensibles au temps¹⁵. Pour valider davantage la possibilité d’UV-PAM pour l’imagerie des tissus épais, un système UV-PAM en mode réflexion avec un scanner de systèmes microélectromécaniques à un axe étanche a été proposé, démontrant avec succès l’examen histopathologique peropératoire des tissus du côlon et du foie humains¹⁶. Étant donné que l’image UV-PAM originale est en niveaux de gris tandis que l’image colorée H& E de référence est en couleurs rose et violet, il est difficile pour les pathologistes d’interpréter directement les images UV-PAM. Pour résoudre ce problème, un algorithme d’apprentissage en profondeur a été proposé pour transférer des images UV-PAM en niveaux de gris dans des images virtuelles colorées H & E en temps quasi réel afin que les pathologistes puissent comprendre les images sans aucune formation supplémentaire¹⁷.

Ce travail rapporte un système UV-PAM à grande vitesse et à toit ouvert qui peut être utilisé de la même manière que les microscopies optiques conventionnelles, fournissant à la fois des images histologiques originales en niveaux de gris et des images virtuellement colorées assistées par un algorithme d’apprentissage en profondeur. Une tranche de cerveau de souris fixée au formol et incorporée à la paraffine (FFPE) est imagée par le système UV-PAM pour démontrer la similitude entre nos images UV-PAM virtuellement colorées et les images standard colorées H & E, montrant son potentiel pour les applications SMA.

Toutes les expériences sur les animaux effectuées dans le cadre de ce travail sont approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université des sciences et technologies de Hong Kong.

1. Système UV-PAM à toit ouvert (Figure 1)

1. Éclairage optique
   1. Utilisez un laser à semi-conducteurs pompé par diode Q-switch (longueur d’onde de 266 nm) comme source d’excitation.
   2. Utilisez deux lentilles convexes pour étendre le faisceau laser et placez un sténopé près du point focal de la première lentille convexe pour effectuer un filtrage spatial.
   3. Réfléchissez le faisceau laser vers le haut à l’aide d’un miroir galvanométrique 1D (1D GM).
   4. Utilisez une lentille d’objectif pour focaliser le faisceau laser et passer à travers le centre d’un transducteur à ultrasons (UT) en forme d’anneau avant d’être étroitement focalisé sur un échantillon.
2. Détection par ultrasons
   1. Utilisez un UT focalisé en forme d’anneau pour détecter les ondes ultrasonores. Les diamètres intérieur et extérieur de la zone active UT sont respectivement de 3 mm et 6 mm. Distance focale: 6,3 mm; fréquence centrale: 40 MHz; -6 dB de bande passante : 84 %.
   2. Fixez l’UT dans un réservoir d’eau fabriqué en laboratoire avec une fenêtre optiquement transparente en bas, recouverte d’un mince couvercle en quartz pour permettre à la lumière UV de passer. Assurez-vous que la zone active de l’UT est orientée vers le haut. Fixez le réservoir d’eau à un étage manuel à deux axes pour contrôler la position latérale de l’UT.
   3. Allumez le laser UV, ajustez la position de l’UT pour permettre au faisceau laser de passer à partir du centre de l’UT. Éteignez le laser UV. Ensuite, remplissez le réservoir d’eau avec de l’eau désionisée pour immerger complètement l’UT.
   4. Connectez la sortie de l’UT à deux amplificateurs (gain total = 56 dB) et connectez la sortie du deuxième amplificateur à une carte d’acquisition de données (DAQ).
3. Fixez un porte-échantillon à un étage manuel de l’axe Z qui est connecté à des étages motorisés xy. Le porte-échantillon a un trou vide qui permet à la lumière UV de passer. Fixez quatre morceaux de ruban adhésif double face entourant le trou.
4. Alignement du système
   1. Fixez du ruban adhésif noir à une glissière en verre et placez la glissière en verre pour couvrir le trou du porte-échantillon, le ruban noir étant orienté vers le bas. Appuyez sur la glissière en verre pour vous assurer qu’elle est fixée sur le porte-échantillon. Ensuite, abaissez le porte-échantillon pour immerger le verre glissé dans l’eau.
   2. Déconnectez l’UT en forme d’anneau et les amplificateurs, connectez l’UT au pulseur/récepteur et connectez la sortie du pulseur/récepteur à un oscilloscope. Faites fonctionner le pulseur/récepteur en mode Pulse-Echo. Réglez l’amplitude de l’impulsion et le gain de l’impulsion/récepteur sur 6 et 20 dB, respectivement.
      1. Activez le pulseur/récepteur et ajustez la position z du porte-échantillon pour trouver la position du plan focal acoustique où les signaux ultrasonores sont maximaux.
   3. Réglez le pulseur/récepteur en mode de transmission et réglez le gain sur 60 dB. Activez la sortie laser. Ajustez la position z de l’objectif pour maximiser les signaux de sonorisation mesurés par l’oscilloscope.
   4. Ajustez la position latérale de l’UT en forme d’anneau pour rendre le signal PA généré symétrique et maximal, ce qui signifie que les foyers optiques et acoustiques sont coalisés dans le plan latéral. Ensuite, ajustez la position z du porte-échantillon pour maximiser les signaux PA.
   5. Répétez les étapes 1.4.3 et 1.4.4 pour optimiser à la fois la symétrie et l’amplitude des signaux PA. Enregistrez le délai (c’est-à-dire le temps qu’il faut pour que les ondes PA atteignent l’UT) sur l’oscilloscope lorsque les signaux PA sont optimisés.
   6. Déplacez le porte-échantillon pour imager différentes positions du ruban noir. Ajustez la planéité du porte-échantillon de manière à ce que les signaux de sonorisation générés à partir de chaque position de la bande noire aient le même délai que celui mesuré à l’étape 1.4.5.
   7. Éteignez le laser et connectez l’UT aux deux amplificateurs.

2. Préparation de l’échantillon

1. Tranche de cerveau de souris FFPE
   1. Sacrifiez une souris avec une surdose d’anesthésie. Ensuite, récoltez le cerveau de la souris en suivant le protocole décrit dans la référence¹⁸.
   2. Fixez le cerveau récolté dans du formol tamponné neutre à 10% pendant 24 h.
   3. Traiter le cerveau fixe par déshydratation avec de l’alcool gradué, élimination avec du xylène et incorporation avec de la paraffine comme décrit dans la référence¹⁹.
      REMARQUE: Traiter l’échantillon dans une hotte aspirante.
   4. Découpez le cerveau intégré en fines tranches (5 μm d’épaisseur) à l’aide d’un microtome. Placez les tranches d’échantillon sur des lames de quartz. Sécher les lames dans un four à 60 °C pendant 1 h.
   5. Déparaffinez les sections à l’aide d’un agent de nettoyage (voir Tableau des matériaux), qui élimine la paraffine pour éviter les signaux de fond élevés, car la paraffine est très absorbante avec l’excitation UV.
      REMARQUE: Traiter l’échantillon dans une hotte aspirante.
2. Tranche de cerveau de souris fraîche
   1. Sacrifiez une souris avec une surdose d’anesthésie. Ensuite, récoltez le cerveau de la souris en suivant le protocole énoncé dans la référence¹⁸.
   2. Lavez le cerveau de la souris avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le sang.
   3. Coupez une tranche de l’échantillon de cerveau (~ 5 mm d’épaisseur) à la main, puis lavez l’échantillon avec du PBS pour enlever le sang sur la section transversale.

3. Procédures expérimentales

1. Placement de l’échantillon
   1. Préparez un réservoir d’échantillons fabriqué en laboratoire avec une membrane transparente UV (polyéthylène, ∼10 μm d’épaisseur). Ajouter une goutte d’eau à la membrane, puis placer l’échantillon biologique sur le réservoir d’échantillon pour couvrir l’eau. Dans le cas de l’échantillon de tranche FFPE, utilisez du ruban adhésif pour fixer la lame de verre sur la membrane.
   2. Placez le réservoir d’échantillon contenant l’échantillon sur le porte-échantillon, en veillant à couvrir le trou vide du porte-échantillon.
2. Réglez le laser UV sur le mode de déclenchement externe. À l’aide de notre programme LabVIEW construit en laboratoire (voir Tableau des matériaux), définissez les paramètres de numérisation comme suit.
   1. Réglez le taux de répétition laser à 55 kHz; réglez le type de signale du pilote GM sur triangulaire et la plage de tension d’entraînement sur 0,018 V (représentant ±0,018 V; facteur d’échelle: 1 V / °). Réglez GMnum sur 22 et dy sur 2 de sorte qu’après chaque 22 déclencheurs laser, le GM termine un quart de la période de balayage et que le moteur de l’axe y déplace une taille de pas de 0,3125 μm. Réglez dx sur 192 de sorte que lorsque le moteur de l’axe y atteint la position prédéfinie (par exemple, 5 mm), le moteur de l’axe x déplace une taille de pas de 30 μm.
      REMARQUE : La plus petite taille de pas incrémentiel est définie sur 0,15625 μm pour les moteurs des axes x et y. Par conséquent, lorsque dy = 2, la taille de l’étape est égale à 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, et lorsque dx = 192, la taille de l’étape est égale à 0,15625 x 192 = 30 μm. Pour numériser toute la surface de 5 x 5 mm², le moteur de l’axe des x se déplacera de 5000 μm / 30 μm = 167 fois, ce qui signifie que 167 sous-images seraient cousues pour obtenir une image entière. Voir la figure 2 pour la trajectoire de balayage du système UV-PAM.
3. Commencez l’analyse d’essai sur une petite région en définissant le nombre d’étapes mobiles des moteurs des axes x et y (xn = 10 et yn = 1000). Ajustez l’étage manuel de l’axe Z pour placer l’échantillon sur le plan focal afin d’obtenir un maximum de signaux de sonorisation.
4. Déplacez les moteurs des axes x et y vers le point de départ souhaité, définissez la région de numérisation en définissant les valeurs xn et yn , puis démarrez le programme d’acquisition d’images (voir Tableau des matériaux).
5. Après l’acquisition de l’image, éteignez le laser, retirez le porte-échantillon et stockez les échantillons biologiques.
6. Pour les tissus biologiques frais, conservez les échantillons dans du formol tamponné neutre à 10 %.
7. Pour les tranches de cerveau de souris FFPE, colorez avec H&E en suivant le protocole indiqué dans la référence²⁰ pour obtenir les images colorées H&E correspondantes.
8. Utilisez les signaux PA collectés pour reconstruire l’image de projection d’amplitude maximale à l’aide d’un algorithme de traitement d’image construit en laboratoire (voir Tableau des matériaux).

La figure 1 montre le schéma du système UV-PAM à grande vitesse. Dans cette configuration, les voies d’excitation optique et de détection par ultrasons sont du même côté et en dessous de l’échantillon, formant un mode réfléchissant et un système à toit ouvert. Ainsi, il est convivial et adapté à l’imagerie d’échantillons épais.

La figure 2 montre la trajectoire de balayage du système UV-PAM pendant l’imagerie. La sous-image de chaque section (par exemple, une surface de 5 mm x 30 μm) est d’abord générée à l’aide d’un algorithme d’interpolation dispersée, puis une image entière (par exemple, une surface de 5 mm x 5 mm) est obtenue en assemblant toutes les sous-images à l’aide d’un algorithme de traitement d’image personnalisé (voir Tableau des matériaux).

La figure 3A et la figure 3B montrent les images UV-PAM et H&E d’une tranche de cerveau de souris FFPE, respectivement, qui ont toutes deux un champ de vision de 5 x 5 mm². L’algorithme de traitement d’image est accessible depuis Github via le lien fourni dans la Table des matériaux. Le temps d’acquisition de l’image était inférieur à 18 min. La figure 3C-F montre les images zoomées des régions marquées de la figure 3A, où les noyaux cellulaires individuels peuvent être clairement résolus. Plus important encore, les noyaux cellulaires correspondants peuvent être trouvés dans les images standard colorées H & E (Figure 3G-J), montrant la grande précision du système actuel pour l’imagerie cellulaire. Pour transférer l’image UV-PAM en niveaux de gris vers une image virtuelle colorée H&E, un algorithme d’apprentissage profond¹⁷ (voir Table des matériaux) a été appliqué, ce qui prendrait moins de 30 s pour une image de 8000 x 8000 pixels. Les images zoomées correspondantes sont illustrées à la figure 3K-N. Les images UV-PAM virtuellement colorées fournissent presque les mêmes informations structurelles que les images colorées H&E, ce qui est prometteur pour la traduction clinique du système UV-PAM actuel.

Figure 1 : Schéma du système UV-PAM à grande vitesse et à toit ouvert. (A) La configuration du système. (B) Photographie du porte-échantillon et d’un réservoir d’eau fixé à un étage manuel à deux axes. (C) Photographie du transducteur à ultrasons en forme d’anneau fixé dans le réservoir d’eau et du réservoir d’échantillonnage qui recouvre le trou du porte-échantillon. D) Photographie du réservoir d’échantillonnage avec la membrane et l’échantillon qui seraient placés sur le porte-échantillon. UV: Ultraviolet; DAQ : Carte d’acquisition de données; GM : Miroir galvanométrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Trajectoire de balayage du système UV-PAM pendant l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats expérimentaux de l’imagerie UV-PAM avec coloration virtuelle basée sur l’apprentissage profond. (A) Image UV-PAM d’une tranche de cerveau de souris FFPE. (B) Image standard colorée H&E de la même tranche. Barres d’échelle: 1 mm. (C-F) Images zoomées des régions marquées en A. (G-J) Images colorées H&E correspondantes des régions marquées en B. (K-N) Images virtuellement colorées correspondantes à l’aide d’un algorithme d’apprentissage en profondeur. Barres d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En résumé, un système UV-PAM à grande vitesse et à toit ouvert a été démontré pour l’imagerie histologique. Les instructions détaillées sur la configuration du système, l’alignement optique, la préparation des échantillons et les procédures expérimentales sont présentées. Le programme d’acquisition d’images est accessible à partir de Github via le lien fourni dans la table des matériaux. La résolution latérale du système actuel est d’environ 1,2 μm qui a été mesurée expérimentalement dans une publication récente²¹. Une tranche de cerveau de souris a été imagée pour démontrer que le système actuel peut obtenir une image histologique en 18 minutes pour une zone de 5 x 5 mm², ce qui est une taille typique de la biopsie cérébrale²². Bien que l’image originale soit en niveaux de gris, à l’aide d’un outil de coloration virtuel numérique activé par un algorithme d’apprentissage en profondeur, le système actuel peut en outre fournir des images virtuellement colorées en temps quasi réel, assurant une adaptation facile pour les pathologistes à interpréter les images. En tant que technique d’image sans étiquette, le système UV-PAM actuel peut également fournir des images histologiques pour des échantillons de tissus frais non traités. D’autres exemples (y compris des échantillons de tissus congelés et frais) ont été démontrés dans une publication précédente¹⁷. Les résultats expérimentaux montrent le potentiel élevé du système UV-PAM assisté par apprentissage profond actuel dans les applications SMA.

L’un des avantages du système UV-PAM est que le système est mis en œuvre en mode réflexion, permettant l’imagerie de tissus épais. En outre, le système UV-PAM à toit ouvert permet de placer l’échantillon sur la fenêtre de balayage (la membrane du réservoir d’échantillons), qui a un fonctionnement similaire à celui des microscopies optiques traditionnelles. Par conséquent, ce système est plus convivial que d’autres systèmes qui nécessitent que les échantillons soient pris en sandwich par deux membranes^11,14. De plus, en utilisant un GM 1D avec un laser UV à haut taux de répétition, le système UV-PAM actuel peut atteindre une vitesse d’imagerie élevée avec une rentabilité plus élevée par rapport au système utilisant l’excitation multifocale²³.

Actuellement, la vitesse d’imagerie est principalement limitée par le taux de répétition du laser et le budget de photons. Avec un laser qui a un taux de répétition élevé et une énergie d’impulsion élevée, le temps d’imagerie peut être encore raccourci. Une autre limitation du système est que l’échantillon ne peut être ajusté grossièrement au plan focal de l’objectif qu’en trouvant les signaux de sonorisation maximaux, au lieu d’afficher une image en temps réel pour que les utilisateurs puissent visualiser si l’échantillon est au point. Pour afficher une image en temps quasi réel, 2D GM peut être appliqué.

Il y a deux étapes critiques dans le protocole: (a) l’exigence confocale des foyers optiques et acoustiques doit être optimisée pour atteindre une sensibilité de détection élevée; b) la plage de balayage du GM sur l’axe des x doit être inférieure à la focale acoustique de l’UT en forme d’anneau pour maintenir une sensibilité de détection élevée similaire (dans la configuration actuelle, la plage de balayage est d’environ 30 μm ±15 μm). Sinon, des effets de vignettage évidents sur les bords se produiraient lorsque plusieurs sous-images sont assemblées pour obtenir une image entière.

T. T. W. W. et V. T. C. T. ont un intérêt financier dans PhoMedics Limited, qui, cependant, n’a pas soutenu ce travail. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les auteurs tiennent à remercier la Commission de l’innovation et de la technologie de Hong Kong pour son soutien financier (ITS/036/19).