Étiquetage des vaisseaux sanguins dans le cerveau de Teleost et l’hypophyse utilisant la perfusion cardiaque avec un DiI-fixatif

L’article décrit un protocole rapide pour l’étiquetage des vaisseaux sanguins dans un poisson téléostéen par perfusion cardiaque de DiI dilué dans fixatif, en utilisant Medaka (Oryzias latipes) comme un modèle et en se concentrant sur le cerveau et le tissu hypophysaire.

Les vaisseaux sanguins innervent tous les tissus des vertébrés, permettant leur survie en fournissant les nutriments nécessaires, l’oxygène, et les signaux hormonaux. Il est l’un des premiers organes à commencer à fonctionner pendant le développement. Les mécanismes de formation des vaisseaux sanguins sont devenus un sujet d’intérêt scientifique et clinique élevé. Chez les adultes, cependant, il est difficile de visualiser la système vasculaire chez la plupart des animaux vivants en raison de leur localisation profonde dans d’autres tissus. Néanmoins, la visualisation des vaisseaux sanguins reste importante pour plusieurs études telles que l’endocrinologie et la neurobiologie. Alors que plusieurs lignées transgéniques ont été développées dans le zébrafish, avec des vaisseaux sanguins directement visualisés par l’expression de protéines fluorescentes, aucun outil de ce type n’existe pour d’autres espèces de téléostéens. En utilisant Medaka (Oryzias latipes) comme modèle, le protocole actuel présente une technique rapide et directe pour étiqueter les vaisseaux sanguins dans le cerveau et l’hypophyse en perfusant à travers le coeur avec fixatif contenant dii. Ce protocole permet l’amélioration de notre compréhension sur la façon dont le cerveau et les cellules pituitaires interagissent avec le sang système vasculaire dans les tissus entiers ou des tranches de tissu épais.

Les vaisseaux sanguins jouent un rôle essentiel dans le corps des vertébrés car ils fournissent les nutriments nécessaires, l’oxygène et les signaux hormonaux à tous les organes. En outre, depuis la découverte de leur implication dans le développement du cancer¹, ils ont reçu beaucoup d’attention dans la recherche clinique. Bien qu’un certain nombre de publications ont étudié les mécanismes permettant la croissance des vaisseaux sanguins et la morphogenèse, et un grand nombre de gènes importants pour leur formation ont été identifiés², beaucoup reste à comprendre en ce qui concerne l’interaction entre les cellules ou les tissus et le sang circulant.

Visualisation de système vasculaire sanguine dans le cerveau et l’hypophyse est important. Neurones dans le cerveau exigent un apport élevé d’oxygène et de glucose³, et l’hypophyse contient jusqu’à huit importants types de cellules productrices d’hormones qui utilisent le flux sanguin pour recevoir le signal du cerveau et envoyer leurs hormones respectives à différents organes périphériques^4,5. Alors que chez les mammifères, le système de portail à la base de l’hypothalamus nommé l’éminence médiane, relie le cerveau et l’hypophyse⁶, un tel pont sanguin clair n’a pas été décrit dans les poissons téléostéens. En effet, dans les téléostéens, les neurones préoptico-hypothalamiques projetaient directement leurs axones dans la pars nerveuse de l’hypophyse⁷ et innervent principalement les différents types de cellules endocriniennes directement^8,9. Cependant, certains de ces neurones ont leurs terminaisons nerveuses situées dans l’espace extravasculaire, à proximité des capillaires sanguins¹⁰. Par conséquent, la différence entre le poisson téléostéen et les mammifères n’est pas si claire, et la relation entre la vascularisation du sang et le cerveau et les cellules pituitaires nécessite une plus grande investigation dans les poissons téléostéens.

Le zébrafish a, dans de nombreux aspects, un système vasculaire anatomiquement et fonctionnellement comparable à d’autres espèces de vertébrés¹¹. Il est devenu un modèle de vertébrés puissant pour la recherche cardiovasculaire principalement grâce au développement de plusieurs lignées transgéniques où les composants du système vasculaire sont étiquetés avec des protéines de reporter fluorescentes¹². Cependant, l’anatomie exacte du système circulatoire peut varier entre les espèces, ou même entre deux individus appartenant à la même espèce. Par conséquent, la visualisation des vaisseaux sanguins peut être d’un intérêt élevé aussi chez d’autres espèces de téléostéens pour lesquelles les outils de transgenèse n’existent pas.

Plusieurs techniques ont été décrites pour étiqueter les vaisseaux sanguins chez les mammifères et les téléostéen. Ceux-ci comprennent l’hybridation in situ pour les gènes spécifiques à la vasculature, la coloration de la phosphatase alcaline, la microangiographie et les injections de colorant (pour un examen voir¹³). Fluorescent lipophilique cationique indocarbocyanine colorant (DII) a d’abord été utilisé pour étudier la mobilité latérale des lipides membranaires comme il est conservé dans les bicouches lipidiques et peut migrer à travers elle^14,15,16. En effet, une molécule de DiI est composée de deux chaînes d’hydrocarbures et de chromophores. Alors que les chaînes d’hydrocarbures s’intègrent dans la membrane cellulaire bicouche lipidique des cellules en contact avec elle, les chromophores restent sur sa surface¹⁷. Une fois dans la membrane, les molécules de DiI diffusent latéralement dans la bicouche lipidique qui aide à tacher les structures membranaires qui ne sont pas en contact direct avec la solution DiI. Injecter une solution de DiI par perfusion cardiaque, va donc étiqueter toutes les cellules endothéliales en contact avec le composé permettant l’étiquetage direct des vaisseaux sanguins. Aujourd’hui, le DiI est également utilisé à d’autres fins de coloration, telles que l’imagerie à molécule unique, la cartographie du destin et le traçage neuronale. Fait intéressant, plusieurs fluorophores existent (avec différentes longueurs d’onde d’émission) permettant la combinaison avec d’autres étiquettes fluorescentes, et l’incorporation ainsi que la diffusion latérale de DiI peut se produire dans les tissus vivants et fixes^{18, le 19}.

Le formaldéhyde, découvert par Ferdinand Blum en 1893, a été largement utilisé à l’heure actuelle comme le produit chimique préféré pour la fixation des tissus^20,21. Il montre une grande spécificité pour la plupart des cibles cellulaires et préserve la structure cellulaire^22,23. Il préserve également les propriétés fluorescentes de la plupart des fluorophores, et peut donc être utilisé pour fixer des animaux transgéniques pour lesquels des cellules ciblées expriment des protéines de reporter fluorescentes.

Dans ce manuscrit, un protocole antérieur développé pour étiqueter les vaisseaux sanguins dans les petits modèles expérimentaux de mammifères²⁴ a été adapté à l’utilisation chez les poissons. L’intégralité de la procédure ne prend que quelques heures à effectuer. Il démontre comment perfuser une solution fixateur de formaldéhyde contenant DII dans le coeur de poisson afin d’étiqueter directement tous les vaisseaux sanguins dans le cerveau et l’hypophyse du modèle de poissons medaka. Medaka est un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie, qui se trouve principalement au Japon. C’est un organisme modèle de recherche avec une suite d’outils moléculaires et génétiques disponibles²⁵. Par conséquent, l’identification des vaisseaux sanguins dans cette espèce ainsi que dans d’autres permettra d’améliorer notre compréhension sur la façon dont le cerveau et les cellules pituitaires interagissent avec système vasculaire sanguine dans les tissus entiers ou des tranches de tissu épais.

Toutes les manipulations animales ont été effectuées conformément aux recommandations pour le soin et le bien-être des animaux de la recherche à l’Université norvégienne des sciences de la vie, et sous la supervision d’enquêteurs autorisés.

1. préparation des instruments et des solutions

1. Préparer la solution de stock de DiI dissoudre 5 mg de cristal de DiI dans 1,5 mL tube en plastique avec 1 mL de 96% EtOH. Vortex pour 30 s et garder recouvert à l’aide d’une feuille d’aluminium.
   Remarque: La solution stock DiI peut être conservée dans l’obscurité à-20 ° c pendant plusieurs mois.
2. Préparez le porte-poisson (figure 1a) en coupant un morceau de polystyrène à 5 cm de longueur, 3 cm de largeur et 2 cm d’épaisseur, et en le collant à un plat en plastique de 9 cm de diamètre. Faire un trou de 3 cm en forme de bateau avec une lame de scalpel dans le polystyrène.
3. Préparer le système de perfusant (figure 2) en ajoutant une canule en plastique de 30-50 cm de long à l’extrémité de l’aiguille.
4. Préparer 40 mL de solution de paraformaldéhyde (PFA) fraîche à 4% en diluant 10 mL de PFA à 16% avec 30 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube en plastique de 50 mL.
5. Préparer 10 mL de solution fixative/DiI en diluant 1 mL de solution stock de DiI dans 9 mL de 4% de PFA fraîchement préparé dans un tube en plastique de 10 mL. Garder dans l’obscurité jusqu’à l’utilisation.
   Remarque: Les cristaux de DiI qui ne sont pas dissous peuvent être conservés dans le tube de solution courante, et l’éthanol neuf peut être ajouté pour préparer la nouvelle solution de stock de DiI (Voir l’étape 1,1).
6. Préparer 50 mL de stock de tricaïne (MS-222).
   1. Dissoudre 200 mg de poudre de tricaïne dans 48 mL de H₂O. Ajouter 2 ml de base tris 1 M (pH 9). Ajuster à pH 7 avec 1 M HCl et conserver à-20 ° c.
7. Diluer 5 mL de stock de tricaïne dans 50 mL d’eau propre dans un petit verre.
8. Préparer plusieurs pipettes en verre de 5 cm (figure 2) en étirant un capillaire en verre avec un extracteur de pipette en suivant les instructions du fabricant.

2. dissection et perfusion

Remarque: L’PFA est un composé volatil toxique, donc la dissection et la perfusion doivent être effectuées dans une hotte ou dans une pièce ventilée, et l’utilisateur doit porter un masque à gaz.

1. Préparez les outils de dissection, y compris les petits ciseaux, et une forceps forte et une puissante avant la dissection.
2. Remplissez la seringue avec la solution préparée de PFA/DiI en la plaçant dans le tube de 50 mL et en la dressant. Placez ensuite l’aiguille avec la canule à l’extrémité de la seringue (figure 2).
3. Fixez la seringue au banc à l’aide de plusieurs bandes placées dans des directions différentes, ajustez la position du microscope et du siège pour obtenir une bonne position pour la dissection et pour appuyer sur le piston de la seringue (figure 1B).
   Remarque: Dans ce protocole, le coude est utilisé pour appuyer sur le piston de la seringue, mais d’autres options de possibilités peuvent être utilisées, par exemple, l’aide d’une autre personne.
4. Euthanasier le poisson avec une overdose de tricaïne en plaçant le poisson dans la solution préparée à l’étape 1,7. Attendre 30 s et tester les réflexes du poisson en saisissant sa nageoire caudale avec la pince. Le poisson peut être utilisé quand il a cessé de répondre aux stimuli.
5. Placez le poisson dans le support de poisson avec son abdomen orienté vers le haut et épinglez une aiguille dans l’extrémité de la tête et une autre au-dessus de la queue pour garder le poisson en place.
6. Ouvrez l’abdomen antérieur avec les ciseaux en coupant horizontalement la couche superficielle de la peau.
7. À l’aide de forceps, enlevez la peau au-dessus du cœur jusqu’à ce qu’un accès clair au ventricule et à l’artériel de Bulbus soit fourni (figure 3).
8. Ajouter une pipette en verre à l’extrémité du capillaire et briser l’extrémité de la pointe de la pipette en verre.
   Remarque: Le trou de la pointe cassée devrait être assez grand pour laisser le liquide sortir, mais encore assez petit pour entrer facilement dans le tissu. La pipette en verre peut être réutilisée si elle n’est pas cassée ou obstruée.
9. Amenez la pipette en verre près du ventricule et ajoutez la pression au piston de la seringue avec le coude pour forcer le liquide à sortir.
10. Épinglez le ventricule du cœur avec la pipette en verre tout en ajoutant de la pression à la seringue.
11. Directement après, perforent le sinus veineux avec forceps pour permettre au sang de quitter la circulation.
    Remarque: Le ventricule du cœur devient plus fragile à cause du fixatif. Il devient également moins rouge que le sang est dilué avec la solution fixative/DiI.
12. À partir du ventricule, ajustez l’angle de la pipette en verre pour trouver l’entrée du Bulbus arteriosus. Amener l’ouverture de la pipette à l’intérieur du Bulbus artériel comme illustré à la figure 2, et ajouter plus de pression sur la seringue.
    Remarque: Le Bulbus artériel est transparent et le tissu est élastique. Lors du remplacement du sang par le DII/fixatif, la pipette en verre à l’intérieur du cœur devrait devenir plus visible et en ajoutant de la pression, la taille de l’artériel de Bulbus devrait se développer. Cette étape est cruciale pour s’assurer que suffisamment de pression a été utilisée pour remplacer tout le sang avec la solution fixative/DiI, et que tous les vaisseaux sanguins ont été atteints. Souvent, en cas de succès, le PFA provoque des contractions musculaires et le poisson se déplace.
13. Continuer à ajouter de la pression sur la seringue pendant 30-60 s en gardant toujours la pipette en verre à l’intérieur du Bulbus arteriosus.
14. Retirez la pipette en verre et les aiguilles du poisson.
15. Disséquer le cerveau et l’hypophyse, et incuber les tissus en PFA frais de 4% dans le PBS pendant 2 h dans l’obscurité à la température ambiante.
    Remarque: La dissection du cerveau et de l’hypophyse a été décrite en détail de deux manières différentes par fontaine et coll.²⁶ et Ager-Wick et coll.²⁷. En raison de la fixation, le tissu devient assez dur et le lien fragile entre le cerveau et l’hypophyse peut être rompu. Après la dissection, le traitement post-fixation peut également être effectué pendant la nuit à 4 ° c.
16. Rincez le tissu deux fois en PBS pendant 10 min avant de préparer l’imagerie.
    Remarque: Le tissu peut ensuite être monté entre la glissière et le feuillet de recouvrement avec des entretoises entre les deux et le support de montage pour l’imagerie confocale (voir figure 4), ou sectionné avec un vibratome comme décrit en détail dans fontaine et coll.²⁶ avant de monter entre glisser et couvrir le glissement pour l’imagerie avec un stéréomicroscope (voir figure 4).

Ce protocole démontre une procédure étape par étape pour étiqueter les vaisseaux sanguins dans le cerveau de Medaka et l’hypophyse, et en même temps fixer le tissu. Après l’étiquetage par injection cardiaque d’une solution fixateur contenant du DII dans le cœur, les vaisseaux sanguins peuvent être observés sur des tranches à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent (figure 4) ou sur des tissus entiers à l’aide d’un microscope confocale (figure 5). Soit sur la tranche de tissu épais ou sur le tissu entier, l’architecture de la vascularisation du sang peut être observée en trois dimensions. Les tranches de tissu peuvent être étiquetées pour des protéines ciblées spécifiques en utilisant des protocoles d’immunofluorescence standard après la fin de la fixation, et sur des lignées transgéniques où les cellules d’intérêt expriment des protéines de reporter fluorescentes (figure 6). Cela permet d’enquêter sur les interactions entre les vaisseaux sanguins et d’autres types de cellules spécifiques. Ici, par exemple, l’utilisation d’une lignée transgénique de Medaka où les cellules productrices de protéines fluorescentes vertes (GFP) ont révélé l’emplacement des cellules de LH hypophysaire²⁸. On peut observer que ces cellules envoient des extensions vers les vaisseaux sanguins. Certains vaisseaux sanguins peuvent ne pas être étiquetés correctement si la perfusion est sous-optimale. Cela peut être le cas, par exemple, si la solution est injectée dans le ventricule cardiaque au lieu du Bulbus arteriosus, ou si l’utilisation d’une pression trop basse et/ou pour une période trop courte sur le piston de la seringue (figure 7). Enfin, en imagé le même tissu avec les mêmes paramètres d’imagerie, on a montré que l’intensité de l’étiquetage diminuait après quatre jours, le signal étant plus étendu (figure 8).

Figure 1 : Images de la plaque de maintien pour la perfusion du poisson (A) et la configuration d’injection (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La figure 2 : Schéma du cœur de poisson medaka et système de perfusion montré avec l’emplacement Idel de l’aiguille en verre dans le coeur pour une perfusion réussie. La tête de flèche montre où percer le cœur pour permettre au sang de laisser la circulation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Image du côté ventrale du poisson ouvert, avec le cœur exposé à la perfusion. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Image de la système vasculaire sanguine dans une tranche de tissu cérébral et hypophysaire de Medaka. Un medaka adulte a été perfutilisé avec une solution fixateur contenant du dii. Le cerveau et l’hypophyse ont été disséqué et fixé pendant la nuit. Les tissus ont été montés en d’agarose à 3% et ont été sectionnés avec un vibratome avant l’imagerie avec un microscope à fluorescence. Tous les vaisseaux sanguins étiquetés avec DII sont vus à travers toute la section montrant le système vasculaire dans le cerveau et l’hypophyse. OT = tectum optique; Tél = télencéphalon; Hyp = hypothalamus; Fosse = hypophyse; CB = Cerebellum; Hind = hindbrain. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : rendu 3D d’un confocale z-Stack de la système vasculaire sanguine dans l’hypophyse medaka. Un medaka adulte a été perfutilisé avec une solution fixateur contenant du dii. Le cerveau-hypophysaire ont été disséqué et fixé pendant la nuit. L’hypophyse a été disséqué du cerveau et monté entre une glissière et une lèvre avec des entretoises IB entre, avant l’imagerie avec un microscope confocale. Z-Stack a été enregistré et un rendu 3D a été effectué à l’aide du logiciel Fiji et du plug-in 3D Viewer²⁹. L’ensemble de la vascularisation du sang hypophysaire pourrait être observée en 3D. RPP = rostral pars distalis; PPD = pars distalis proximal; PI = pars intermedia. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Z projection de z-Stack confocale à partir d’une tranche de tissu de Medaka transgénique où le promoteur Lhβ contrôle l’expression de la protéine de reporter fluorescente verte. Un adulte TG (LHB: hrgfpii) medaka a été perfusé avec une solution fixateur contenant dii. Le cerveau-hypophysaire ont été disséqué et fixé pendant la nuit. Les tissus ont été montés en d’agarose à 3% et ont été sectionnés avec un vibratome. Certaines cellules productrices d’hormones, les cellules de LH dans ce cas, l’envoi d’extensions (têtes de flèche) vers les vaisseaux sanguins peuvent être observés, probablement pour détecter les signaux du sang et/ou libérer leurs hormones dans la circulation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Image de système vasculaire sanguine dans une tranche de tissu cérébral et hypophysaire de Medaka mal perfusés. Un medaka adulte a été mal perfusés avec une solution fixateur contenant DII en injectant la solution dans le ventricule seulement. Le cerveau-hypophysaire ont été disséqué et fixé pendant la nuit. Les tissus ont été montés en d’agarose à 3% et ont été sectionnés avec un vibratome avant l’imagerie avec un microscope confocale. Les vaisseaux sanguins ont été mal étiquetés avec DiI et certains d’entre eux n’ont pas été étiquetés du tout. OT = tectum optique; Tél =, télencéphalon; Hyp = hypothalamus; Fosse = hypophyse; CB = Cerebellum; Hind = hindbrain. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Imagerie temporelle de la vascularisation du sang étiqueté dans la section du tissu cérébral-hypophysaire de Medaka. Un medaka adulte a été perfutilisé avec une solution fixateur contenant du dii. Le cerveau-hypophysaire ont été disséqué et fixé pendant la nuit. Les tissus ont été montés en d’agarose à 3% et ont été sectionnés avec un vibratome avant l’imagerie avec un stéréomicroscope directement après le montage (a), et 4 jours après le montage (B) avec les mêmes paramètres d’imagerie. Notez que l’étiquetage a diminué et s’est étalé avec le temps. OT = tectum optique; Tél = télencéphalon; Hyp = hypothalamus; Fosse = hypophyse; CB = Cerebellum; Hind = hindbrain. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La perfusion cardiaque avec le DiI a précédemment été utilisée pour étiqueter des vaisseaux sanguins dans plusieurs espèces modèles²⁴, y compris les poissons téléostéens¹³_.

Comme DII est directement livré à la membrane cellulaire endothéliale par perfusion dans le vasculature, il est possible d’augmenter le rapport signal-bruit en augmentant la concentration de DII dans la solution fixateur. En outre, le fluorophore fournit une coloration intense lorsqu’il est excité avec un blanchiment minimal permettant une émission relativement longue durée^18,30. En outre, l’étiquetage peut rester pendant plusieurs jours et être utilisé en combinaison avec d’autres techniques d’étiquetage qui nécessitent des traitements légers, comme dans l’immuofluorescence (IF)³¹.

Cependant, cette technique a quelques limitations. Après le retrait de la solution fixateur, l’étiquetage et l’imagerie des tissus doivent être effectués aussi rapidement que possible parce que l’intensité de l’étiquetage va s’affaiblir, et le signal se diffuse avec le temps (figure 8). Ce processus sera encore plus rapide lors de l’utilisation de détergents qui augmentent la porosité de la membrane. En outre, parce que l’PFA est un composé volatil toxique, plusieurs précautions doivent être prises lors de l’exécution de cette expérience. Pour minimiser les aspects dangereux de ce protocole, on peut perfuser une solution de DiI et PBS avant de disséter le tissu d’intérêt et de le fixer avec la solution PFA juste après la perfusion. Cependant, cela ne peut être effectué que pour les tissus de petite taille, car la pénétration de PFA dans les échantillons de tissus plus grands sera moins efficace que pendant la perfusion.

Le taux de réussite de ce protocole est amélioré par la formation, il est donc prévu que les chercheurs auront besoin de temps pour se familiariser avec les différentes étapes de la technique. Par exemple, la perfusion de la solution dans l’artériel de Bulbus est une étape particulièrement critique du protocole et exige une certaine formation pour obtenir un bon résultat. En gardant l’aiguille dans la bonne position pendant assez longtemps pendant la perfusion n’est pas trivial, et nécessitera une formation par le manipulateur.

Enfin, ce protocole est optimisé pour les adultes medaka mais il peut être utilisé pour d’autres espèces avec quelques adaptations. Différents tissus d’intérêt, ou même différents stades de la vie de l’animal dans le même tissu nécessitera également des optimisations pour la concentration de DiI et le temps de perfusion ainsi que le matériel utilisé (tailles d’aiguille et de seringue par exemple).

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Nous remercions le Dr Shinji Kanda pour la démonstration de la perfusion cardiaque avec une solution fixateur dans medaka, Mme Lourdes Carreon G Tan pour l’aide à l’élevage medaka, et m. Anthony Peltier pour les illustrations. Ce travail a été financé par la NMBU et par le Conseil de recherche de la Norvège, Grant number 248828 (programme Digital Life Norvège).