In Vivo Évaluation du développement de cals de Fracture au cours de la guérison osseuse chez la souris en utilisant un dispositif d’ostéosynthèse IRM-compatible pour le fémur de souris

L’évaluation du développement des tissus dans le CAL de fracture au cours de la guérison osseuse endochondrale est indispensable pour surveiller le processus de guérison. Nous rapportons ici l’utilisation d’une résonance magnétique imagerie (IRM)-fixateur externe compatible pour le fémur de la souris pour permettre à MRI scans pendant la régénération osseuse chez la souris.

Guérison des fractures d’os endochondral est un processus complexe impliquant le développement de tissu fibreux, cartilagineux et osseux dans le CAL de fracture. La quantité des différents tissus dans le CAL fournit des informations importantes sur la rupture des progrès de la guérison. Disponible en vivo techniques longitudinalement surveille l’évolution de tissu de cals dans des études précliniques de guérison des fractures à l’aide de petits animaux comprennent la radiographie numérique et imagerie µCT. Toutefois, ces deux techniques ne sont en mesure de distinguer les tissus minéralisés et non minéralisée. Par conséquent, il est impossible de distinguer le cartilage de tissu fibreux. En revanche, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) visualise les structures anatomiques basés sur leur teneur en eau et pourrait donc être en mesure d’identifier une façon non envahissante des tissus mous et le cartilage dans le CAL de fracture. Nous rapportons ici, l’utilisation d’un fixateur externe compatible IRM-compatible pour le fémur de la souris pour permettre des IRM au cours de la régénération osseuse chez la souris. Les expériences ont démontré que le fixateur et un dispositif de montage sur mesure permettent répétitives IRM, permettant ainsi une analyse longitudinale du développement des tissus fracture-Cal.

Guérison de la fracture secondaire est la forme la plus courante de la guérison osseuse. C’est un processus complexe imitant des aspects spécifiques du endochondrale ontogénique ossification^1,2,3. L’hématome au début de la fracture se compose principalement de cellules immunitaires, de granulation et de tissu fibreux. Faible tension d’oxygène et des souches biomécaniques hautes entravent une différenciation ostéoblastique à l’écart de la fracture, mais promouvoir la différenciation des cellules progénitrices en chondrocytes^4,5,6. Ces cellules commencent à proliférer à l’endroit de la blessure pour former une matrice cartilagineuse assurant une stabilité initiale de l’OS fracturé. Durant la maturation des cals, devenus hypertrophiques, les chondrocytes subissent l’apoptose, ou trans-se différencient en ostéoblastes. La néovascularisation dans la zone de transition du cartilage-aux-os fournit des niveaux élevés d’oxygène, permettant la formation de tissu osseux⁷. Après le pont osseux de l’écart de la fracture, stabilité biomécanique est augmentée et ostéoclastique remodelage du cal fracture externe se produit pour avoir des os physiologique de contour et la structure³. Par conséquent, les quantités de tissu fibreux, cartilagineux et osseux dans le CAL de fracture fournissent des informations importantes concernant l’OS, processus de guérison. Perturbés ou retardé la guérison devient visible par des altérations du développement des tissus cals tant chez les humains et les souris^8,9,10,11. Disponible en vivo techniques pour surveiller longitudinalement cals développement des tissus en préclinique fracture guérison des études à l’aide de petits animaux comprennent la radiographie numérique et µCT imagerie^12,13. Toutefois, ces deux techniques ne sont capables de distinguer les tissus minéralisés et non minéralisée. En revanche, l’IRM fournit des tissus mous excellent contraste et pourrait donc être en mesure d’identifier les tissus mous et le cartilage dans le CAL de fracture.

Travaux antérieurs a montré des résultats prometteurs pour post mortem MRI chez la souris avec les fractures articulaires des IRM¹⁴ et in vivo chez des souris pendant intramembranaires défect osseux-guérison¹⁵. Cependant, les deux études a également déclaré limité contraste tissus et la résolution spatial. Nous avons précédemment démontré la faisabilité de haute résolution en vivo IAM pour une évaluation longitudinale de formation de cals doux pendant endochondrale murine fracture guérison¹⁶. Nous rapportons ici le protocole afin d’utiliser un fixateur externe compatible IRM-compatible pour ostéotomie du fémur chez la souris, afin de surveiller le développement des tissus cals longitudinalement au cours de la fracture de l’os endochondral processus de guérison. La conception d’un dispositif de montage sur mesure pour l’insertion du fixateur externe assuré une position normalisée lors d’analyses répétées.

animal toutes les expériences conformé au règlement international pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par les autorités de régulation régionales (no 1250, Regierungspräsidium Tübingen, Allemagne). Toutes les souris ont été maintenus en groupes de deux à cinq animaux par cage sur une lumière de 14 h, 10 h circadien sombre avec l’eau et la nourriture fournis ad libitum.

1. préparation du matériel chirurgical et de pré-traitement des souris

1. stériliser tout chirurgicale. Utiliser une température d’autoclavage de 120 à 135 ° C pendant 20-30 min de temps de stérilisation.
2. Achat C57BL/6 souris ou souris d’une autre souche qui varient de 19 à 35 g de poids corporel. Suivre les soins appropriés aux animaux et des protocoles expérimentaux conformément aux lignes directrices nationales qui est approuvé par le chercheur ' s Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme. Prévoyez un minimum de la période d’acclimatation de 7 jours avant de commencer la procédure.
3. Fournir une analgésie à toutes les souris par l’intermédiaire de l’eau potable, un jour avant l’opération jusqu’au jour troisième postopératoire.

2. Procédure chirurgicale et l’Application du fixateur externe

1. Place la souris dans un tube préchargée avec l’isoflurane et 60 mL/min d’oxygène en 5 à 7 %. Après la perte des réflexes posturaux, retirez le tube d’induction de l’anesthésie de la souris et maintenir l’anesthésie via un masque respiratoire, fournissant de l’oxygène isoflurane et 60 mL/min de 1 à 3 %. Réflexe
   1. moniteur la patte de motif et hind de respiration pendant l’anesthésie. Veiller à ce que le rythme de la respiration est environ 100 cycles/min et le réflexe de la patte arrière est absent.
      ​ Remarque : la quantité de gaz nécessaire ne dépend de l’âge, le sexe, du poids corporel et la souche de souris.
2. Avant la chirurgie, injecter la souris avec une dose unique d’antibiotiques par voie sous-cutanée (clindamycine, 45 mg/kg). En outre, pour le maintien de l’équilibre des fluides physiologique, injecter la souris avec un dépôt de liquide sous-cutanée d’une solution saline de 500 µL (0,9 % NaCl).
3. Pour empêcher la cornée séchage, applique pommade ophtalmique pour les yeux de la souris. Placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant l’anesthésie et une intervention chirurgicale pour maintenir physiologique la température du corps.
4. Enlever la fourrure de la patte droite et frottez la zone chirurgicale avec un désinfectant à base d’alcool. Couvrir la patte arrière droite avec une petite partie d’un gant stérile pour éviter les zones non stériles. Désinfecter le membre postérieur droit trois fois. Placez un drap stérile sur la souris en entier à l’exception de la zone chirurgicale.
5. Incise la peau environ 1 cm longitudinalement le long de la face antérieure du fémur droit avec un scalpel. Séparer carrément le m. biceps femoris et le m. vastus lateralis avec pinces et ciseaux micro. Couper le côté d’origine tendon au trochanter de fémur avec un micro ciseaux pour permettre un accès gratuit à la partie antérolatérale de l’OS. Assurez-vous que le nerf sciatique est conservé.
6. Placer le fixateur externe (rigidité axiale de 3 N/mm, Figure 1 A) parallèles sur le fémur. Percer les trous de forage par cortex avec une mèche de 0,45 mm et placer la céramique montage des goupilles dans les trous de forage manuellement. Commencez par la broche plus proximale, suivie par la broche plus distale et les deux broches dans l’intervalle.
   1. S’assurer qu’il n’est aucune tension, compression ou cisaillement sur le fixateur au cours de la procédure de montage, sinon l’écart atteint ostéotomie ne sera pas suffisant en raison de la relaxation du fixateur.
7. Humidifier l’OS avec une petite quantité de NaCl stérile pour éviter la déshydratation au cours de la procédure de sciage.
8. Créer une ostéotomie de 0,4 mm à travers l’OS entier entre les deux broches internes à l’aide d’une scie à fil 0,4 mm gigli.
   NOTE : Éventuellement, une scie oscillante micro peut être utilisé pour créer l’ostéotomie. Veillez à éviter les copeaux métalliques de la scie à l’aire de l’ostéotomie.
9. Rincer l’écart de l’ostéotomie soigneusement avec 2 mL de NaCl stérile pour retirer des éclats d’os entre le deux cortex de fracturé.
10. Adapter les muscles à l’aide d’une suture continue avec une suture résorbable (voir Table des matières). Adapter ensuite la peau à l’aide des sutures non résorbables interrompus (voir Table des matières). Pour éviter la blessure mordre, ne pas placer la suture à la partie crânienne de la plaie.
    Remarque : N’utilisez pas de colle de peau ou de clips depuis souris habituellement Retirez-la de la blessure causant des dommages à la peau.
11. , Nettoyer la zone chirurgicale avec un désinfectant et placez la souris dans sa cage. moniteur la souris et offre suffisamment de chaleur (par exemple par rayons infrarouges) jusqu'à ce qu’il est tout à fait réveillé. surveiller l’eau, consommation de nourriture et poids corporel après la chirurgie pour Assurez-vous que l’animal n’est pas dans la douleur et de détresse. Fournir une analgésie à toutes les souris par l’intermédiaire de l’eau potable jusqu’au troisième postopératoire jour.
    Remarque : La souris peuvent être hébergés dans les groupes de jusqu'à quatre animaux.
12. Contrôler la souris ' activité s sur 1 à 5 jours après la chirurgie. Pendant ce temps, la souris devait porter le poids sur le membre opéré. Dans le cas contraire, la souris doivent être exclue de l’analyse.

3. IRM et analyse d’images

1. avant l’IRM scanner procédure, anesthésier la souris selon le protocole de mesures 2.1 et 2.3 et garder le rythme respiratoire environ 100 cycles/min. ajouter le fixateur externe à la patte droite de la souris avec soin dans un dispositif de montage sur mesure ( Figure 1 B, C).
   1. Veillez à éviter la flexion ou compression du fixateur au cours de cette étape car cela peut interférer avec la guérison des fractures.
      Remarque : L’IRM peut être effectuée aussi tôt que 3 jours après la chirurgie, selon le protocole expérimental et soin des animaux.
2. Placer la souris sur un berceau à température contrôlée pour être introduit dans l’appareil de MRI. Fixer le dispositif de montage rigide à la bobine de tête de quatre éléments.
3. Données de l’IRM acquérir en utilisant un système dédié de MRI de petits animaux haut champ fonctionnant à 11,7 T.
   ​ Remarque : la géométrie de l’IRM données acquisition est alignée sur le fémur, orthogonalement aux vis.
   1. D’acquérir des données en appliquant une densité protonique réprimés graisse multi-slice TSE séquence (PD-TSE) à l’aide des paramètres d’acquisition : echo/répétition temps TE = 5,8 ms/TR = 2 500 ms, résolution Δr = 52 × 52 × 350 µm³, champ de vision (FOV) = 20 × 20 mm² et bande passante Δω = 150 KHz.
   2. Remarque : le temps d’acquisition total de 22 tranches est 36 min.
4. Ouvrir les données acquises avec l’analyse d’images. Entrez la taille du voxel comme 0,05 x 0,05 x 0,35 mm ³. Segmenter les différents tissus dans le CAL de fracture (OS, cartilage, le tissu fibreux/moelle épinière) basées sur leur intensité avec seuillage semi-automatique comme suit.
   1. Cliquez le " Edit nouveau Label champ ", cliquez sur " ajouter matériel " et renommez le matériau à " Cal ". Distinguer la zone cals les tissus environnants, fondée sur le signal hypo-intense le périoste en faisant le " Lasso " outil.
   2. Click " ajoute au matériel ". Cliquez sur " ajouter matériel " et renommez le matériau à " cartilage ". Segmenter le cartilage à l’aide de la " seuil " outil et " sélectionner uniquement le matériel actuel " de " Cal ". Cliquez sur " cartilage " et " ajoute au matériel ". Répétez ces étapes avec " OS " et " du tissu fibreux/moelle osseuse ".
5. Générer des reconstructions 3D du fémur fracturé basés sur les données de segmentation de tissu à l’aide de logiciels d’analyse image. Cliquez sur " Surface générer ", appliquer " aucun " pour " Type de lissage " et cliquez sur " vue de Surface ".
   NOTE : Très petites zones hyper intense entourant le frDS de la fracture cortex sont susceptibles d’être des artefacts en raison de la transition entre osseuses et des tissus mous. Ces zones devraient être exclus de l’analyse. Les zones hyper-intense au milieu de la fracture Cal pendant la phase d’endochondrale de fracture guérison représentent tissu cartilagineux. Des zones hypo-intense dans le CAL de fracture distal de l’écart de l’ostéotomie à la phase d’ossification endochondrale et avec la même intensité tout au long de toute fracture Cal à plus tard la guérison stades représentent le tissu nouvellement formé de Cal osseux. Bien que ces régions ont un signal hypo-intense, l’intensité du signal de la maturité osseuse (cortex) est encore plus bas. Après seuillage l’intensité du signal pour le tissu osseux et le tissu cartilagineux dans le CAL de fracture, marquer le reste comme la moelle osseuse et le tissu fibreux. Sont des valeurs pour la segmentation des tissus : tissu osseux (y compris le cortex mûr, l’OS trabéculaire et cals osseux) est segmenté dans la plage 1-3.3 (intensité du signal normalisé au cortex mûr), du tissu fibreux/moelle osseuse dans la fourchette de 3,4 à 5,4, et cals cartilagineux dans la plage de 5.5 et 6.2.
6. Si nécessaire, répéter l’IRM longitudinalement au cours de la fracture, processus de guérison. Pour surveiller le développement de cals cartilagineux, scan des souris sur 10, 14 et 21 jours après la chirurgie.
   Remarque : Les points dans le temps peuvent dépendre le protocole expérimental et soin des animaux.

Tout d’abord, le succès de l’intervention chirurgicale peut être confirmé par l’analyse de l’IRM (voir exemple à la Figure 2). Tous les quatre épingles doivent être placés au milieu de la tige fémorale. La taille de l’écart de l’ostéotomie doit être comprise entre 0,3 et 0,5 mm. Si la taille de l’écart de l’ostéotomie varie grandement de ces valeurs, la souris doivent être exclue de l’analyse.

Deuxièmement, l’évaluation des analyses longitudinales pendant la fracture processus chez le même animal de guérison fournit des informations sur le développement des tissus des cals. Si les souris sont scannés au jour 10, 14 et 21 (voir exemple à la Figure 3), le tissu cartilagineux est visible au milieu de la Cal de fracture jour 10 (zone de cartilage relative = 30,8 %) et le 14e jour (zone de cartilage relative = 29,0 %) et diminue jusqu'à 21 jours après chirurgie (zone de cartilage relative = 10,5 %) (Figure 3). Tissu osseux est visible à la périphérie du cal fracture au jour 10 (la surface osseuse relative = 7,2 %), augmente jusqu’au jour 14 (la surface osseuse relative = 15,6 %), et corps de raccordement s’effectue jusqu’au 21e jour (la surface osseuse relative = 45,7 %).

Troisièmement, après la segmentation des différents tissus dans le CAL de fracture à l’aide de logiciels d’analyse image, 3D images de fémur fracturé et le CAL de fracture peuvent être générés. Dans l’exemple illustré dans la Figure 4, un fémur tout balayé le jour 26 après que fracture s’affiche. Cortex mûr est marqué en gris, les broches en céramique sont marqués en jaune, cals des tissus mous sont marquée en vert, le tissu cartilagineux est marqué en rouge et cals osseux est marquée en violet.

Figure 1 : Fixateur externe avec broches de montage en céramique et dispositif de montage de MRI. (A), le corps en plastique du fixateur externe est indiqué, ainsi que les quatre broches de fixation en céramique qui sont compatibles avec l’IRM. Echelle : 1 cm. (B) l’assistée par ordinateur de dessin de l’appareil de montage sur mesure pour insertion du fixateur externe au cours de l’IRM est illustrée. Le fixateur externe au fémur droit de la souris est insérée dans le soulagement de l’appareil de montage. Ensuite, l’appareil est branché sur la bobine de tête de quatre éléments avant l’analyse. Echelle : 0,4 cm. souris (C) placé dans le dispositif de montage (en bleu), attaché à la bobine de tête de 4 éléments (blanc). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : PD-TSE qualité de l’image d’un fémur fracturé 3 jours après la chirurgie. Une tranche centrale d’un fémur fracturé numérisé sur jour 3 après que chirurgie est indiquée. BM : la moelle osseuse ; B: osseuse ; FX : écart de fracture. Barre d’échelle : 0,5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Suivi longitudinal du développement de cals de fracture à l’aide de la technique d’IRM. MRI central tranches du fémur fracturé d’un souris jour numérisée sur (A) 10 et 14 jours (B) (C) 21 jours après la chirurgie sont affichés. Tissu cartilagineux hyper-intense est visible au milieu de la Cal de fracture les jours 10 et 14 et décroît jusqu'à 21 jours après la chirurgie. Tissu osseux hypo-intense est visible à la périphérie du cal fracture au jour 10, augmente jusqu’au jour 14, et combler de corps se produit jusqu’au 21e jour. BM : la moelle osseuse ; CG : tissu cartilagineux ; B: tissu osseux. Barre d’échelle : 0,5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Reconstruction 3D à partir d’un fémur fracturé scanné le jour 26 après chirurgie. Cortex mûr est marqué en gris, les broches en céramique sont marqués en jaune, cals des tissus mous sont marquée en vert, le tissu cartilagineux est marqué en rouge et cals osseux est marquée en violet. L’image a été générée à l’aide de logiciels d’analyse image. Echelle : 0,4 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Modifications et dépannage :

L’objectif principal de cette étude était de décrire un protocole pour l’utilisation d’un fixateur externe compatible MRI pour ostéotomie du fémur chez la souris avec la possibilité de surveiller le développement des tissus cals longitudinalement pendant le processus de guérison des fractures des os endochondral. La conception d’un dispositif de montage sur mesure pour l’insertion du fixateur externe assuré une position normalisée lors d’analyses répétées. Segmentation de tissu semi automatique permet d’analyser des quantités de tissu fibreux, cartilagineux et osseux dans le CAL de fracture. En outre, des reconstructions 3D des images de l’IRM permettent de visualisation de la fracture endochondrale processus dans chaque souris individuelles de guérison.

Étapes critiques au sein du protocole :

Des opérations plus critiques de l’intervention chirurgicale à l’aide du fixateur externe compatible MRI sont : (1) éviter tout dommage au nerf sciatique pendant la chirurgie, sinon la souris ne sera pas en mesure de poids ours dans les 5 jours après l’ostéotomie et doivent être exclue de une analyse plus approfondie. (2) Évitez de tension, de compression ou cisaillement insiste sur l’articulateur au cours de la procédure de montage, sinon l’écart de l’ostéotomie n’aura pas une taille normalisée et la forme. En outre, assurez-vous de monter le fixateur parallèle à l’axe longitudinal du fémur, assurant une fixation stable de l’ostéotomie. (3) Évitez les copeaux métalliques de la scie si on emploie un fil de gigli scie, puisque ceux qui n’interférera pas avec l’IRM procédure de numérisation.

Les étapes plus critiques de l’IAM procédure de numérisation sont : (1) Assurez-vous d’Évitez de flexion ou de compression du fixateur pendant l’insertion et le retrait de l’appareil de montage car cela peut interférer avec la guérison des fractures. (2) assurer le contrôle de la température appropriée au cours de la procédure de numérisation pour maintenir la température physiologique du corps.

Importance en ce qui concerne les méthodes existantes et les limites de la Technique :

Études antérieures ont montré des résultats prometteurs pour post-mortem IRM chez la souris avec les fractures articulaires¹⁴ et MRI de in vivo chez des souris ayant intramembranaires-défect osseux guérison¹⁵. Cependant, les deux études a également déclaré limité contraste tissus et la résolution spatial. Nous avons précédemment démontré la faisabilité et la précision de haute résolution en vivo IRM pour une analyse longitudinale du soft au début, la formation de cals et intermédiaires des phases de fracture de guérison chez les souris en comparant la nouvelle technique d’IRM avec le or normes µCT et histomorphométrie¹⁶. Cependant, nous avons également constaté que la résolution spatiale de l’IRM est nettement inférieure à la résolution de µCT ex vivo . Il s’agit d’une limitation claire de la technique d’IRM par rapport aux techniques concurrentes, y compris les ex vivo , mais aussi en vivo µCT.

Applications futures :

Les perspectives d’avenir pour l’utilisation de l’IRM au cours des études murins-guérison des fractures sont : (1) combinaison d’IRM à l’aide d’agents de contraste pour mesurer le flux sanguin dans le membre blessé en position. (2) combinaison de MRI et PET scans, ainsi que de l’étiquetage des cellules avec des particules d’oxyde de fer pour la cellule traite des expériences^17,18,19,20superparamagnétiques.

L’auteur Matthys Romano est un employé de RISystem AG Davos, Suisse qui produit les implants et les instruments spécifiques utilisés dans cet article de l’implant. Tous les autres auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Nous remercions Sevil Essig, Stefanie Schroth, Verena Fischer, Katja Prystaz, Yvonne Hägele et Anne Subgang excellent soutien technique. Nous remercions également la Fondation de recherche allemande (CRC1149, INST40/499-1) et l’Allemagne AO Trauma Foundation pour le financement de cette étude.