Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Comprendre la fonction des processus essentiels chez les bactéries est difficile. Microscopie à fluorescence avec des colorants spécifiques à la cible peut éclairer clé dans la progression de la croissance et cycle cellulaire des cellules microbiennes. Ici, Agrobacterium tumefaciens est utilisé comme une bactérie modèle pour mettre en évidence les méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour la caractérisation des processus essentiels.

Le processus cellulaire de base telles que la réplication de l’ADN et la ségrégation, la synthèse des protéines, la biosynthèse de la paroi cellulaire et la division cellulaire s’appuient sur la fonction des protéines qui sont essentielles pour la survie de bactéries. Une série de colorants spécifiques à la cible peut être utilisée comme sondes afin de mieux comprennent ces processus. Coloration avec colorants lipophiles permet l’observation de la structure de la membrane, la visualisation des microdomaines lipidiques et détection des bulles de la membrane. Utilisation des acides aminés fluorescentes-d (FDAAs) pour sonder les sites de la biosynthèse du peptidoglycane peut indiquer des défauts potentiels dans la biogenèse pariétale ou patrons de croissance cellulaire. Enfin, taches d’acide nucléique peuvent indiquer des défauts possibles en ségrégation réplication ou chromosomique d’ADN. Cyanine ADN taches étiquette vivant des cellules et sont adapté pour la microscopie Time-lapse permettant des observations en temps réel de nucléoïde morphologie au cours de la croissance cellulaire. Protocoles pour l’étiquetage de la cellule peuvent être appliqués à des mutants déplétion protéique à repérer les défauts dans la structure de la membrane, biogenèse pariétale ou ségrégation des chromosomes. Par ailleurs, Time-lapse microscopie peut être utilisée pour surveiller les changements morphologiques comme une protéine essentielle est supprimée et peut fournir des indications supplémentaires en fonction de la protéine. Par exemple, l’appauvrissement de la couche de protéines essentielles division cellulaire entraînant filamentation ou ramification, considérant que la déplétion des protéines de croissance cellulaire peut-être causer des cellules à devenir plus courts ou plus rond. Ici, les protocoles pour la croissance cellulaire, l’étiquetage spécifique à la cible et la microscopie Time-lapse sont fournis pour le phytopathogène bactéries Agrobacterium tumefaciens. Ensemble, colorants spécifiques à la cible et le Time-lapse microscopie permettent la caractérisation des processus essentiels dans a. tumefaciens. Enfin, les protocoles fournis peuvent être facilement modifiés pour sonder les processus essentiels chez d’autres bactéries.

Progression dans le cycle cellulaire bactérienne nécessite la coordination de nombreux processus, y compris la biosynthèse de la membrane et la paroi cellulaire, réplication de l’ADN et la ségrégation et la division cellulaire. Pour bien comprendre la complexité de la biologie de la cellule bactérienne, il est nécessaire d’étudier ces phénomènes essentiels ; Cependant, c’est une tâche non triviale puisque la viabilité cellulaire est compromise lorsque les éléments clés de ces voies sont mutagénisées tant. Microscopie à épifluorescence couplée avec des colorants spécifiques à la cible est une approche puissante pour sonder ces processus essentiels dans le type sauvage et les souches bactériennes mutantes.

Colorants de peptidoglycane spécifique incluent antibiotiques fluorescents (vancomycine-FL, bocillin-FL) et des acides aminés fluorescentes-d (par exemple, 7-hydroxycoumarine-3-carboxylic acide 3-amino-d-alanine, HADA ; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanine , NADA ; tétraméthylrhodamine-3-amino-d-alanine ; TADA). Chez les bactéries Gram-positives, l’utilisation de concentrations sublétales de fluorescents antibiotiques analogues aux sites de la biosynthèse du peptidoglycane de la sonde a été une stratégie efficace pour révéler le peptidoglycane insertion patrons^{1,2, 3,4}. Alors que le marquage fluorescent à la vancomycine a été utilisé pour acquérir des connaissances sur le peptidoglycane modes d’insertion dans des bactéries Gram-négatives fixe⁵, la membrane externe fournit généralement une barrière de perméabilité qui empêche l’utilisation de la fluorescence antibiotiques comme une sonde pour la biosynthèse du peptidoglycane dans des cellules vivantes. En revanche, des impulsions courtes de fluorescent-d acides aminés ou des acides aminés d avec les groupes fonctionnels bi-orthogonale étiquette par covalence régions d’insertion récente de peptidoglycane dans un large éventail de la vie des cellules bactériennes^6,7. Modes d’insertion de peptidoglycane qui ont été observées avec les acides aminés d synthétiques comprennent ponctuée et septale (Escherichia coli et Bacillus subtilis), polar et septale (Agrobacterium tumefaciens et Listeria monocytogenes), seule septale (Staphylococcus aureus) et apicale (Streptomyces venezuelae)^6,7. Ces observations indiquent que les bactéries présentent divers patrons de paroi cellulaire biogenèse et que l’utilisation d’acides aminés d synthétiques comme sondes pour l’examen des motifs de croissance est une stratégie utile dans de nombreuses bactéries.

Les colorants qui étiquette les chromosomes bactériens comprennent le liant spécifique petit sillon de l’acide désoxyribonucléique (ADN) (4, 6-diamidino-2-phénylindole ; DAPI) et colorants cyanine de haute affinité (vert et Orange ; Voir la liste des matériaux). DAPI souillant des cellules fixes aide dénombrement des bactéries présentes dans les échantillons environnementaux⁸, tandis que la coloration DAPI de cellules vivantes est utilisée pour indiquer la viabilité bactérienne⁹. En revanche, cyanine dyes comme Orange et vert sont souvent décrits comme cellule « morte » imperméants membrane taches d’énumérer des cellules non viables⁹. Remarquablement, lorsque ces réactifs sont utilisés pour sonder la morphologie du nucléoïde bactérienne au cours de la croissance cellulaire, DAPI, Orange et vert ont été tous avéré membrane perméable et capable de marquage des cellules vivantes¹⁰. Dans vivre cellules d’Escherichia coli , DAPI, coloration de l’ADN apparaît diffuse en raison de l’auto-fluorescence du cytoplasme et de cellules colorés au DAPI, des expositions répétées aux rayons ultraviolets (UV) perturbe le nucléoïde structure¹⁰. Coloration d’e. coli ou de b. subtilis avec Orange révèle que ce colorant est membrane perméable et fournit la fluorescence longue durée lors de la liaison à l’ADN dans des cellules vivantes sans impact sur la croissance cellulaire, réplication de l’ADN ou ségrégation des chromosomes¹⁰ . Ces observations suggèrent que cyanine ADN colorants peuvent être utilisés pour surveiller la morphologie des nucléoïdes au cours de la croissance cellulaire dans beaucoup de bactéries.

Phospholipid-specific stryl colorants tels que N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phényle) hexatrienyl) dibromure de pyridinium (4-64 ; Voir la liste des matériaux) sont des composés cationiques et associer préférentiellement avec une charge négative phospholipides tels que cardiolipine et phosphatidylglycérol¹¹. Des profils distincts sont observées lorsque 4-64 est utilisé pour indiquer la membrane des bactéries différentes. Chez Escherichia coli, 4-64 est enrichi en polonais, en bandes le long de la paroi latérale et dans les sites de la division de la fin pre-divisional des cellules de¹². Chez Bacillus subtilis, 4-64 étiquetage permet la visualisation des lipides spirales¹³. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 étiquettes la membrane externe et on observe un motif caractéristique « fer à cheval » dans lequel le pôle de croissance est dépourvue d’étiquetage^14,15. Ces observations indiquent que ces bactéries présentent des distributions de lipides hétérogène en raison de la présence de domaines lipidiques qui contribuent à l’asymétrie cellulaire. Changements dans 4-64 étiquetage telles que la présence de marquage diffus, bulles ou de vésicules, invaginations ou rétrécissement de la membrane peut être instructif pour la caractérisation des mutants qui touchent la distribution ou la biosynthèse des lipides.

Au-delà de la coloration des cellules, il est nécessaire de déterminer la fonction des protéines participant au processus essentiels. La caractérisation de protéines essentielles est techniquement difficile car il n’est pas possible de supprimer les gènes essentiels et d’étudier les conséquences phénotypiques. Ainsi, des approches alternatives qui appauvrissent la protéine ont vu le jour. Par exemple, un gène essentiel peut être mis sous le contrôle d’un promoteur inductible plutôt que son promoteur natif. Promoteurs inductibles répondent aux petites molécules telles que ; zinc¹⁶, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)^{17,18,19,20,21}, arabinose,²²,²³du vanillate^17,, et xylose²³, donc la transcription du gène cible cesse et la protéine d’intérêt est épuisée lorsque l’inducteur est supprimé. Les approches alternatives pour épuisement des protéines essentielles d’intérêt incluent riborégulateurs synthétique²⁴ qui utilisent des interactions de petite molécule-RNA faire obstacle à la transcription de gènes cibles, CRISPR interférence^25,26 à bloc la transcription des gènes cibles et protéine inductible dégradation^27,28 , qui utilise des balises de peptides de protéines cibles pour la dégradation par la protéase ClpXP. Souches de déplétion ne fournissent que peu de temps pour la caractérisation avant les cellules perdent la viabilité, imagerie microscopique des cellules au fil du temps pendant la déplétion protéique est donc une approche puissante pour la caractérisation. En effet, la microscopie des cellules bactériennes vivantes a permis aux chercheurs de mieux comprendre les processus biologiques fondamentaux, y compris les mécanismes d’entretien de forme cellulaire, sécrétion et compartimentation²⁹.

A. tumefaciens est une plante bactérienne pathogène³⁰ et ingénieur en génétique naturelle^31,32. Ainsi, des mécanismes associés à la pathogénicité, y compris host-pathogen interactions^33,34,35, sécrétion³⁶et hôte transformation^{30,31, 37} ont été étudiées. Pour concevoir des stratégies pour prévenir les maladies de a. tumefaciens médiation ou améliorer la transformation des plantes, les processus essentiels pour la survie d’a. tumefaciens doivent être mieux comprises. L’utilisation de colorants spécifiques à la cible et le développement récent d’une stratégie de déplétion protéique pour a. tumefaciens¹⁸ fournit un moyen d’enquêter sur les processus essentiels.

Ici, des protocoles détaillés pour analyse microscopique des souches de type sauvage, mutant et protéine appauvrissement d’a. tumefaciens sont fournis. Les deux premiers protocoles décrivent comment préparer les cellules et étiquetez-les avec des colorants spécifiques à la cible. Le troisième protocole fournit des directives étape par étape pour préparer les coussinets de gel d’agarose (Figure 1) et l’imagerie des cellules bactériennes (Figure 2, Figure 3, , Figure 4). Ces protocoles peuvent également être adaptés pour d’autres bactéries avec des adaptations supplémentaires pour tenir compte des conditions de milieux différents, les taux de croissance, besoins en oxygène et structures cellulaires.

1. croissance des souches d’a. tumefaciens

1. Mise en culture des souches d’a. tumefaciens
   1. Utiliser une pointe en bois de bâton ou pipette stérile pour ensemencer 1 mL de milieu de culture ATGN (voir la liste des matériaux pour la recette) avec une seule colonie de la souche désirée.
      NOTE : Pour les souches d’a. tumefaciens de l’appauvrissement, l’ATGN doit contenir 1 mM IPTG comme inducteur de maintenir la biosynthèse des protéines essentielles.
   2. Cultiver les souches d’a. tumefaciens nuit à ATGN à 28 ° C sous agitation à 225 t/mn.
   3. Mesurer la densité optique des cellules à 600 nm (OD₆₀₀) à l’aide d’un spectrophotomètre. Diluer la culture cellulaire à une OD₆₀₀ = ~0.2 et continue de grandir jusqu'à OD₆₀₀ = ~0.6 est atteint. Pour les souches de l’appauvrissement de la couche, continue de grandir avec inducteur jusqu'à OD₆₀₀ = ~0.6 est atteint.
   4. Utiliser des souches de type sauvage et mutant d’a. tumefaciens OD₆₀₀ = ~0.6 pour une coloration spécifique à la cible ou Time-lapse microscopie (voir les sections 2 et 3.1). Pour les souches de l’appauvrissement de la couche, lavent l’inducteur (voir la section 1.2).
2. Enlèvement d’inducteur pour la caractérisation des souches de déplétion protéique a. tumefaciens
   1. 1 mL de culture exponentielle de granule (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) par centrifugation à 7 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse Bureau à température ambiante.
   2. Pour laver, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans les supports neufs sans inducteur et les cellules de granule, tel que décrit ci-dessus (1.2.1). Laver les cellules 3 fois dans les supports neufs.
   3. Resuspendre le culot final dans les supports neufs et concentrer les cellules à une OD₆₀₀ = ~0.8 pour une coloration immédiate avec des colorants spécifiques cible (section 2 et Figure 4 b-D) ou Time-lapse microscopie (section 3.2 et Figure 4 a) . Alternativement, pré appauvrissent les cellules pendant le temps désiré par les cellules dans les médias sans inducteur avant la coloration et l’imagerie des cellules en croissance.

2. objectif spécifique coloration des cellules d’a. tumefaciens

1. Marquage fluorescent d-amino acide pariétaux
   Remarque : FDAAs sont non toxique des acides aminés d fluorescents qui sont facilement intégrés dans le peptidoglycane d’a. tumefaciens . Cette procédure simple étiquetage sondes croissance patterning dans des cellules vivantes⁶. Protocoles pour la synthèse des quatre FDAAs sont disponible³⁸.
   1. Pellets 500 µL de culture exponentielle (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) par centrifugation à 7 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse de bureau. Resuspendre le culot dans 100 µL de supports neufs.
   2. Ajouter 5 µL de 5 mM FDAA à lavé et concentrée de cellules et incuber pendant 2 min dans l’obscurité.
      NOTE : Limiter l’exposition à la lumière FDAA. Le temps d’incubation varie selon le taux de croissance de la souche. En règle générale, les temps d’incubation devraient être 5 à 10 % du temps doublement⁶.
   3. Les cellules de granule par centrifugation et laver granules cellulaires avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) trois fois.
   4. Resuspendre le culot dans ~ 50 µL de PBS.
      Remarque : Le volume de PBS, utilisé pour la remise en suspension peut-être varier selon le taille de granule.
   5. Appliquer 0,8-1 µL de cellules pour un coussin de gel d’agarose et image à l’aide de la microscopie à épifluorescence immédiatement (voir les sections 3.1 et 3.2).
      1. Vous pouvez également arrêter davantage incorporation d’étiquette en fixant les cellules avec glacee éthanol à 70 %. Resuspendre le culot dans 1 mL d’éthanol glacé à 70 % et incuber sur la glace pendant 15 minutes.
      2. Prélever des cellules par centrifugation et remettre en suspension dans un petit volume de PBS pour l’imagerie à une date ultérieure. Stocker à 4 ° C et l’image des suspensions de cellules dans les 48 heures.
2. ADN coloration au DAPI ou tache Orange
   Remarque : Pour observer l’ADN structure, les cellules sont marquées avec DAPI ou Orange (tache de cellules mortes). Bien que classiquement décrite comme une « tache de cellules mortes », Orange est perméable, PhotoStation et n’affecte pas la croissance des cellules bactériennes, permettant aux cellules vivantes ADN imagerie¹⁰. Dans a. tumefaciens, travaux de marquage Orange bien dans les cellules vivantes et est adapté pour la microscopie Time-lapse (Figure 3). En revanche, l’ultraviolet (UV) exposition à la lumière nécessaire pour l’imagerie de cellules colorés au DAPI est phototoxique (Figure 3) et donc la coloration DAPI est le mieux adaptée pour la coloration des cellules vivantes pour immédiate d’imagerie ou de souiller les cellules fixes.
   1. La coloration des cellules DAPI
      1. 1 mL de culture exponentielle de granule (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) par centrifugation à 7 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse de bureau.
      2. Éventuellement, pour fixer les cellules avant la coloration, resuspendre le culot cellulaire dans 1 mL d’éthanol glacé à 70 %. Incuber sur glace pendant 10-15 min. collecter les cellules par centrifugation comme décrit au point 2.2.1.1.
      3. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS contenant 1 µL de solution mère DAPI (1 mg/mL ; Voir le Tableau des matériaux). Mélanger doucement de pipetage et incuber pendant 5 minutes dans l’obscurité.
      4. Cellules de granule par centrifugation à 7 000 x g pendant 5 min et remettre en suspension dans 1 mL de PBS pour enlever l’excès DAPI. Laver les cellules deux fois plus et Resuspendre le culot dans 50 µL PBS ou médias.
      5. Appliquer 0,8-1 µL de cellules pour un coussin de gel d’agarose et image en utilisant la microscopie à épifluorescence immédiatement. Voir les sections 3.1 et 3.2.
         Remarque : Ce protocole n’est pas optimal pour la microscopie Time-lapse d’observer la dynamique des chromosomes (Figure 3). Envisagez d’utiliser une coloration Orange comme alternative (voir la section 2.2.2).
   2. Coloration orange de cellules vivantes
   3. 1 mL de culture exponentielle de granule (OD₆₀₀ = ~0.4-0.6) par centrifugation à 7 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse de bureau. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS contenant 1 µL de solution mère de Orange (voir la liste des matériaux). Mélanger doucement de pipetage et incuber pendant 5 min dans le noir.
   4. Cellules de granule par centrifugation et remettre en suspension dans 1 mL de PBS pour enlever excès Orange. Laver les cellules deux fois plus et Resuspendre le culot dans 50 µL de PBS.
   5. Appliquer 0,8-1 µL de cellules pour un coussin de gel d’agarose et image en utilisant la microscopie à épifluorescence immédiatement. Voir les sections 3.1 et 3.2.
      Remarque : Ce protocole fonctionne bien avec des cellules vivantes et est adapté pour la microscopie Time-lapse d’observer la dynamique des chromosomes (Figure 3). S’il n’est pas commode d’imager immédiatement, les cellules peuvent être fixés dans glacee éthanol à 70 % (voir point 2.2.1.2).
3. Membrane d’étiquetage
   Remarque : Le colorant fluorescent lipophiles styryl 4-64 a été largement utilisé pour l’observation de la membrane des cellules bactériennes. Contrairement à nombreuses bactéries, 4-64 marqué a. tumefaciens cellules étiqueter pas uniformément, mais plutôt fréquemment présentent un « fer à cheval » modèle^14,15. Remarquablement, le pôle de croissance est presque dépourvu de taches alors que le pôle vieux est étiqueté intensément. Ainsi, 4-64 permet la visualisation des profils de croissance cellulaire et structure de la membrane dans a. tumefaciens.
   1. Ajouter FM 4-64 à une concentration finale de 8 µg/mL à 1 mL de culture de cellules de phase exponentielle et incuber à température ambiante pendant 5 minutes dans l’obscurité.
   2. Granulés de cellules marquées par centrifugation à 7 000 x g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse bureau et Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS. Laver les cellules au total trois fois pour enlever le colorant excédentaire.
   3. Remettre en suspension les cellules dans un petit volume de PBS et comptant sur une garniture d’agarose pour image immédiatement. (Voir les sections 3.1 et 3.2)
      ATTENTION : Les cellules doivent être copiés immédiatement afin d’observer les motifs caractéristiques d’étiquetage.

3. imagerie de cellules a. tumefaciens

1. Préparation de coussinet de gel d’agarose
   Remarque : La Figure 1 contient une séquence d’images (groupe A) et le schéma (groupe B), d’une plaquette d’agarose typiques préparée pour la microscopie Time-lapse. Coussinets de gel d’agarose sont typiquement préparés selon les besoins.
   1. 3.1.1. utiliser un lamelle couvre-objet comme guide et couper une 22 x 22 mm carré de laboratoire film (voir la liste des matériaux) en exécutant un scalpel autour des bords.
   2. Découper un carré dans le centre du film laboratoire laissant un ~ 2-5 bordure mm pour servir un joint pour le coussin de gel d’agarose. Jeter la découpe du centre.
   3. Placez le joint de film sur une lame de verre (75 x 25 mm) nettoyé avec l’ammoniac et nettoyant sans alcool (voir la liste des matériaux) et chauffer jusqu'à ce que le film est un peu fondu sur verre (image du haut dans la Figure 1 a). Pour faire fondre un film de laboratoire, utilisez le tranchant d’un ensemble de bloc thermique à 70 ° C ou faire fondre légèrement au-dessus d’une flamme.
   4. Préparer la solution d’agarose en mélangeant ~0.075 g d’agarose (voir la liste des matériaux) dans 5 mL de médias dans un petit ballon. Chauffer la solution dans un four à micro-ondes avec périodique remuant pour bien mélanger jusqu'à ce que l’agarose est dissoute et la solution est claire. Conserver la solution de gel d’agarose à 55-70 ° C et l’utiliser pour la construction de plusieurs coussins de gel d’agarose dans les 48 heures.
   5. Pipetter médias contenant de 1,2 à 1,5 % d’agarose dans le centre de la garniture.
      Remarque : Le volume des médias est généralement 50-60 µL mais variera selon taille du joint. Ajout de média à une diapositive froide peut causer l’agarose à solidifier trop rapidement, donc la diapositive doit être maintenue sur une surface chaude. Au bord d’un bloc chauffant mis à 70 ° C fonctionne bien. Eau d’agarose ou d’agarose dans la mémoire tampon des solutions comme en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) peuvent être utilisées au lieu de milieux contenant du gel d’agarose pour les applications dans lesquelles la croissance cellulaire continue n’est pas nécessaire. Pour les souches de l’appauvrissement de l’imagerie, inducteur peut être présents ou absents dans les médias. Présence d’inducteur peut être utilisée comme un contrôle alors que l’absence d’inducteur révélera le phénotype de l’appauvrissement de la couche.
   6. Placez une lamelle sur le joint pour répartir l’agarose.
   7. Placez sur une surface plane, cool pour solidifier pour environ 2 min. Evitez surséchage du pad d’agarose comme cela se traduira par une surface ridée sur le coussinet de gel d’agarose et de mise en commun de la suspension cellulaire lorsqu’il est appliqué à la surface.
   8. Glisser délicatement la lamelle sur le coussinet de gel d’agarose.
      ATTENTION : Ne vous précipitez pas à cette étape. Le coussin de gel d’agarose peut facilement déchirer et un tampon d’agarose inégale risquent de compliquer l’imagerie.
   9. Laisser le tampon de gel d’agarose à l’air sec pendant 1 à 2 min à température ambiante jusqu'à ce que la surface du pavé tactile semble sec. À l’aide d’un scalpel, enlever une petite bande d’agarose pour créer une poche d’air (image du milieu, la Figure 1 a) ; la poche d’air est généralement ~ 2 x 7-10 mm et les cellules a. tumefaciens ont tendance à croître plus près de la poche d’air (Figure 1).
      Remarque : Pour l’imagerie de cellules fixes ou dans des conditions où la croissance n’est pas surveillée, une poche d’air n’est pas nécessaire.
   10. Spot 0,8-1 µL de cellules sur le coussinet de gel d’agarose et couvrir avec une lamelle de nouveau. Placez délicatement la lamelle sur le dessus du coussin d’agarose pour distribuer les cellules sur la surface du coussin d’agarose.
   11. Sceller les bords de la lamelle à l’aide de VALAP fondu (voir Table des matières pour la recette ; Figure 1 a, image du bas). Si pour sceller le long de tous les bords et les coins de la lamelle risque de dessèchement de la garniture de l’agarose, qui conduira à la dérive des cellules au cours de l’imagerie. Remarque : L’étanchéité de la lamelle n’est nécessaire pour l’imagerie de Time-lapse à long terme.

Figure 1 : préparation de coussinet de gel d’Agarose. (A) Image de séquence du protocole d’agarose pad préparation. Image 1 est une diapositive avec le joint d’étanchéité de laboratoire pour le film. Dans l’image 2, le coussin de gel d’agarose et la poche d’air sont visualisées. Enfin, image 3 montre le tampon d’agarose complète avec les cellules sous une lamelle et collés avec VALAP. (B), un schéma d’un coussinet de gel d’agarose pour la microscopie Time-lapse est fourni. Principales caractéristiques du coussin d’agarose sont indiquées sur le schéma. (C), la poche d’air a favorisé la croissance d’a. tumefaciens sur coussinets de gel d’agarose. Image de type sauvage a. tumefaciens cellules cultivées sur un coussin de gel d’agarose pour 20 heures sont affichées. Des images ont été prises à des postes de plus en plus éloignés de la poche d’air. La distance entre le bord le plus proche de l’image et la poche d’air est montrée au-dessus de chaque image. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. Imagerie
   NOTE : Le contraste interférentiel différentiel, contraste de phase et l’imagerie de fluorescence incidente est réalisée avec un microscope inversé équipé d’un stade automatisé, filtres standard, une source de lumière LED, mise au point automatique basée sur le matériel, immersion dans l’huile 60 X objectifs (1,4 NA) pour contraste de phase ou de contraste interférentiel différentiel (DIC) et une caméra de charge-coupled-device (EMCCD) électron-multipliant 1K. Le microscope doit être placé dans une pièce à température contrôlée. Alternativement, un stade plus chaud ou une chambre peut servir à maintenir des températures constantes au cours de l’imagerie.
   1. Microscopie à épifluorescence
      Remarque : Pour l’imagerie de fluorescence des cellules vivantes, il est nécessaire de limiter le nombre d’acquisitions d’image et d’optimiser le temps d’exposition afin de minimiser le photoblanchiment et phototoxicité. Pour l’imagerie de chaque colorant, il est recommandé de trouver un temps de pose optimale qui assure la détection par fluorescence suffisante mais n’entraîne pas de photoblanchiment ou phototoxicité. Dans les Figures 2-4, temps d’exposition de 200 ms ont été utilisés pour toutes les images de fluorescence. Pour les séquences de Time-lapse illustrés à la Figure 3, les images ont été acquises toutes les 10 min pendant 3 h.
      1. Placer l’huile à immersion sur l’objectif recherché et placez le chariot inversé dans le support de diapositive sur la scène. Utilisez les boutons de mise au point pour intégrer les cellules de mise au point.
      2. Acquérir des images en phase (ou DIC) et le filtre de fluorescence désirée.
         Remarque : Les maximales longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour les taches utilisées dans la Figure 2, Figure 3et Figure 4 sont les suivants : HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).
   2. Time-lapse microscopie
      Remarque : Pendant le Time-lapse microscopie les fonctionnalités suivantes sont contrôlés par l’ordinateur : x, y et z filtres de position, les volets et fluorescence. Un système autofocus matérielle est optimal pour maintenir l’accent au cours de l’imagerie Time-lapse. Par ailleurs, une boucle d’autofocus logicielle peut être utilisée.
      1. Placer l’huile à immersion sur l’objectif recherché et placez le chariot inversé dans le support de diapositive sur la scène. Utilisez les boutons de mise au point pour intégrer les cellules de mise au point.
      2. En option : Acquérir multiples (x, y) postes. Choisir au hasard 10 champs de cellules à proximité de la poche d’air des plaquettes d’agarose.
      3. Mise en place l’acquisition de séquence de temps à l’image en phase ou DIC à l’intervalle de temps souhaité.
         Remarque : Pour la séquence de Time-lapse illustrée à la Figure 4, DIC images ont été acquises avec une exposition de 30 ms toutes les 10 min pendant 14 h. Lors de l’utilisation d’imagerie de fluorescence au cours de la microscopie Time-lapse, régler le temps d’intervalle et l’exposition acquisition afin de minimiser le photoblanchiment et phototoxicité.

Étiquetage du type sauvage spécifique à la cible A. tumefaciens cellules
Afin d’illustrer que la morphologie cellulaire n’est pas affecté par les étapes de lavage ou un traitement avec 1 % DMSO (qui sert à diluer les colorants fluorescents), les cellules ont été imagées directement à partir de culture (Figure 2 a, panneau de l’extrême gauche), après avoir lavé les cellules par centrifugation telle que décrite en 1.2 (Figure 2 a, panneau de gauche), ou après incubation des cellules avec le 1 % DMSO pendant 10 min et laver les cellules (Figure 2 a, panneau de droite). Ces images illustrent que la morphologie n’est pas affectée par lavage ou la présence de DMSO. En outre, la croissance cellulaire n’est pas touchée par lavage ou le DMSO traitement basé sur l’analyse des courbes de croissance (données non présentées). En outre, a. tumefaciens de fixation à l’éthanol glacé ne provoque pas modifications macroscopiques dans la morphologie (Figure 2 a, panneau à droite).

Ensuite, colorants spécifiques cible ont été utilisés pour observer la biogenèse pariétale, domaines membranaires et l’ADN dans les cellules de type sauvage a. tumefaciens . Les modèles de la nouvelle insertion de peptidoglycane ont été observés après marquage avec trois acides aminés fluorescentes-d : HADA (Figure 2 b, panneau latéral gauche), NADA (Figure 2 b, panneau central) et TADA (Figure 2, panneau de droite). Tous les trois expériences de marquage, étiquetage de peptidoglycane nouvelle s’enrichit au pôle de croissance ou à la cloison des cellules. Ces modèles de croissance ont été constamment observés avec des FDAAs tous les trois, ce qui indique que la sélection FDAA peut être modifiée pour permettre un étiquetage double avec d’autres taches ou les cellules exprimant des protéines fluorescent étiquetés. Le colorant lipophile 4-64 étiquettes préférentiellement la vieille région du pôle des cellules d’a. tumefaciens résultant en forme de fer à cheval caractéristique (Figure 2). Orange (Figure 2D, panneau gauche) tant l’ADN étiquette DAPI (Figure 2D, panneau de droite) au sein de vivent a. tumefaciens cellules. Dans les cellules pre-divisional fin, deux nucléoïdes distincts sont observés avec une coloration Orange, considérant que le marquage ADN apparaît plus diffuse au DAPI coloration (Figure 2D) cohérent avec les résultats des expériences observées dans e. coli¹⁰.

Qualités des teintures d’ADN pour la microscopie Time-lapse
Afin de déterminer si DAPI ou Orange conviennent pour l’imagerie Time-lapse de morphologie nucléoïde au cours de la croissance cellulaire, une proportion égale de non étiquetées, marquées au DAPI et cellules de type sauvage Orange marqué a. tumefaciens ont été mélangées et repéré sur coussinets de gel d’agarose. Au temps 0, images initiales ont été prises à l’aide de contraste de phase, DAPI et TRITC filtres pour déterminer si chaque cellule a été labellisé. Les mélanges de cellule ont été imagées puis trois conditions différentes : microscopie à contraste de phase (1) seulement, (2) phase microscopie à contraste et épifluorescence microscopie la TRITC filtre et (3) phase contraste et épifluorescence en utilisant le filtre DAPI. Les images ont été acquises toutes les 10 minutes pendant 3 heures. Toutes les cellules ont augmenté bien quelle que soit la tache fluorescente utilisée lorsqu’imagée avec phase au microscope à contraste indiquant cette coloration Orange ni DAPI altérer la croissance des cellules (Figure 3, panneau supérieur). Toutes les cellules croissent aussi bien lorsque imagé par microscopie de phase et microscopie à épifluorescence en utilisant le filtre TRITC (Figure 3, panneau central). L’étiquette Orange est soumis à photoblanchiment mais peut être observé pendant au moins 2 h (13 total des expositions de 200 ms), indiquant la pertinence de cette teinture pour la microscopie à court terme de cellules vivantes. Indépendamment de l’étiquetage, toutes les cellules cesse de croître en moins d’une heure lorsqu’imagée par microscopie de phase et microscopie à épifluorescence en utilisant le filtre DAPI (Figure 3, panneau inférieur). Cette observation montre qu’a. tumefaciens est sensible à l’exposition aux UV et indique que les colorants nécessitant un filtre UV pour l’imagerie doivent être évitées pour des expériences de Time-lapse de la microscopie.

Time-lapse d’imagerie et de l’étiquetage spécifique à la cible d’un A. tumefaciens souche de l’appauvrissement de la couche
Saturant le transposon mutagénèse³⁹ tant défaut construire une suppression souche^18,40 indiquent que la protéine maître régulateur, CtrA, est essentielle dans a. tumefaciens. Pour démontrer la valeur de l’analyse au microscope des souches de l’appauvrissement de la couche, un décrites précédemment ctrA appauvrissement souche¹⁸ a été soumis à la caractérisation par microscopie. Dans la Figure 4 a, Time-lapse microscopie a été utilisée pour comparer la croissance des cellules de déplétion ctrA dans quelle expression ctrA a été induite (en haut) et non induits (en bas). En présence de CtrA, une cellule unique a donné lieu à une microcolonie moins 14 h. En revanche, lorsque CtrA a été épuisée, cellules lysent ou a échoué à diviser. Cellules qui ont échoué à diviser ont montré des changements morphologiques bruts y compris arrondi du milieu cellulaire et aux pôles de la cellule. Ces observations suggèrent que le CtrA a une fonction importante dans la régulation de la division cellulaire.

Figure 4 b-D, colorants fluorescents ont été utilisées pour caractériser la souche de déplétion ctrA après induction ou épuisement de ctrA pour 10 h. cellules étaient impulsion étiquetée avec NADA pendant 2 min (Figure 4 b). Quand CtrA était présent (panneau supérieur), la biosynthèse du peptidoglycane polaire a été observée. En revanche, étiquetage de NADA étendue s’est produite dans les pôles et grands milieu cellulaires gonflements s’est produite lorsque CtrA était épuisée. Cette observation concorde avec la synthèse des peptidoglycanes continue malgré une défaillance des cellules à se diviser. La teinture de l’ADN de cyanine Orange a été utilisée pour caractériser la distribution de l’ADN de la souche de déplétion ctrA (Figure 4). Quand CtrA était présent, les cellules en croissance avaient une distribution égale de l’ADN et ségrégation des nucléoïdes était apparente dans une cellule pre-divisional fin ; en revanche, lorsque CtrA a été épuisée, ADN était inégalement répartie dans l’ensemble de cellules. Ces observations suggèrent que CtrA contribue à la réplication de l’ADN ou la ségrégation correcte. Enfin, ctrA épuisement des cellules sont marquées avec 4-64 (Figure 4). En présence de CtrA, la membrane de la cellule a été étiquetée avec un motif caractéristique de fer à cheval dans lequel le pôle de croissance était dépourvu de tache. Dans les cellules épuisées de CtrA, 4-64 est apparu d’étiqueter la membrane entière, même si un pôle a été plus intensément coloré. Cette observation suggère que les membranes demeurent intactes, même si l’organisation microdomaine de lipides peut-être être interrompue lorsque CtrA est épuisée.

Figure 2 : Images représentatives de type sauvage Agrobacterium tumefaciens cellules marquées avec des colorants spécifiques cible. (A) Phase de contraste des images des cellules d’a. tumefaciens avant et après le protocole de lavage, lorsque le traité avec 1 % DMSO ou après fixation à l’éthanol glacé. (B) Polar la croissance des cellules d’a. tumefaciens est montrée par marquage avec les acides aminés d fluorescents HADA, NADA et TADA. (C) coloration de a. tumefaciens avec la tache lipophiles 4-64. (D) la coloration des cellules d’a. tumefaciens avec les colorants d’ADN spécifique Orange et DAPI. Pour panneaux B-D, contraste de phase (en haut) et images épifluorescence (en bas) sont indiquées. Contours de la cellule sont fournis dans les images de fluorescence comme référence. Echelle = 2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Comparaison de l’étiquetage DAPI et Orange de l’ADN en direct a. tumefaciens cellules. Proportions égales de cellules de type sauvage non étiquetées, marquées au DAPI et Orange marqué a. tumefaciens ont été mélangées et repérées sur des tampons en gel d’agarose. Au temps 0, images initiales ont été prises à l’aide de contraste de phase, TRITC et DAPI filtres pour déterminer si les cellules sont marquées. (A) Time-lapse de cellules non étiquetées, marquées au DAPI et Orange marquée par microscopie à contraste de phase. (B) Time-lapse de cellules non étiquetées, marquées au DAPI et Orange marqué imagés par microscopie de phase et en utilisant le filtre TRITC microscopie à épifluorescence. (C) Time-lapse de cellules non étiquetées, marquées au DAPI et Orange marqué imagés par microscopie de phase et microscopie à épifluorescence en utilisant le filtre DAPI. Echelle = 2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Des images représentatives de la souche de déplétion ctrA conditions induits et non induits. (A) microscopie Time-lapse de la souche de déplétion ctrA dans des conditions où la ctrA a été induite (en haut) ou perdu (en bas). Les nombres au-dessus de chaque panneau indiquent la durée en heures. (B) Phase contrast (à gauche) et images (à droite) épifluorescence des cellules marquées avec NADA. (C) Phase contrast (à gauche) et images (à droite) de fluorescence des cellules marquées avec Orange. (D) la Phase contrast (à gauche) et images (à droite) de fluorescence des cellules marquées avec 4-64. Contours de la cellule ont été fournis en images de fluorescence pour référence. Echelle = 2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Ce protocole contient une série de procédures d’enquête sur les souches de type sauvage, mutant et appauvrissement de la couche a. tumefaciens . Il est à noter que toutes les procédures répertoriées dans la section protocole peuvent être facilement adapté pour d’autres souches bactériennes avec modifications pour tenir compte des milieux de croissance, des températures et des taux de croissance.

L’utilisation des colorants spécifiques à la cible est un outil précieux pour fournir une caractérisation détaillée des événements de cycle de cellules en cellules bactériennes. Ici, peptidoglycane d’insertion ont été observées à l’aide d’acides aminés fluorescentes-d, domaines de lipides ont été visualisés avec 4-64, et nucléoïdes ont été marquées au DAPI ou Orange. Chacun des protocoles peut être adapté à d’autres bactéries après optimisation du protocole de lavage et de veiller à ce que le traitement de DMSO n’affaiblit pas la croissance ou la morphologie. Les principales considérations comprennent le choix d’un tampon pour lavages, temps d’incubation pour l’incorporation de l’étiquette et la sélection d’un fluorophore appropriée afin d’éviter l’auto-fluorescence ou pour permettre des études de marquage multiplexes. Par exemple, une alternative à la tache lipophiles membrane rouge fluorescent (4-64) est la tache verte fluorescente membrane (1-43). De même, bleu, vert et rouge-fluorescent-d-aminoacides sont disponibles^6,38 , et le d-aminoacides avec poignées établies peuvent être conjugués à fluorophores courants à clic chimie^6,7. Enfin, en plus de la cyanine orange fluorescente ADN teindre, un vert fluorescent cyanine ADN colorant est disponible et joue bien avec en direct des cellules bactériennes¹⁰. Visualisation des structures de cellule clé étiquetés avec les colorants spécifiques à la cible peut être associée à l’observation des protéines fluorescentes à éclairer mécaniste dans les processus essentiels chez les bactéries.

Ces protocoles incluent les conditions nécessaires pour l’observation microscopique des taches d’appauvrissement de la couche a. tumefaciens et il devrait être possible d’étendre ces approches aux souches de déplétion protéique chez d’autres bactéries. La caractérisation des souches de l’appauvrissement de la couche peut être particulièrement difficile car il y a un délai limité pour achever les enquêtes avant que les cellules cesse de croître ou de lyse. Il est crucial de bien laver les cellules pour éliminer toute trace du colorant excédentaire au cours de l’étiquetage ; Cependant, certaines cellules dépourvus de protéines essentielles ont des défauts dans leurs surfaces cellulaires dont elles risquent d’être sensibles aux étapes de lavage. Augmenter le volume de démarrage de cultures cellulaires peut aider à compenser la perte des cellules au cours des étapes de lavage. Des souches de l’appauvrissement qui ont compromis les membranes cellulaires ou des parois cellulaires pourraient avoir tendance à lorsqu’il est cultivé dans un milieu liquide sans inducteur de la lyse des cellules. Inclusion d’un osmoprotectant (5 % de sucrose fonctionne bien pour a. tumefaciens) peut aider à maintenir la morphologie cellulaire et limiter la lyse cellulaire pendant la déplétion. Il est nécessaire de déterminer empiriquement le laps de temps pour épuiser avant les cellules avant la coloration avec colorant fluorescent approprié. Cellules à membranes permeablized ou parois cellulaires peuvent être sujettes à la cellule lysis ou étiquetage non sélective avec des réactifs fluorescents en imagerie de la fin des points dans le temps l’appauvrissement particulièrement difficiles.

Une étape cruciale pour la microscopie Time-lapse d’a. tumefaciens (ou autres cellules bactériennes) est la préparation de la garniture d’agarose. Le coussin de gel d’agarose doit être de niveau afin d’assurer la bonne mise au point tout au long des expériences de Time-lapse de la microscopie. En outre, la lamelle doit être complètement scellée pour empêcher le coussinet de gel d’agarose de séchage et de changer le plan focal. Pour a. tumefaciens, l’oxygène est nécessaire à la croissance cellulaire. L’imagerie près une poche d’air est nécessaire pour obtenir une croissance robuste d’a. tumefaciens au cours d’expériences de microscopie long time-lapse (Figure 1). Si les cellules ne parviennent pas à se développer ou cesser de croître après seulement quelques heures, il est conseillé de préparer une garniture d’agarose avec une plus grande poche d’air et image près les poches d’air. Même un tampon d’agarose bien construit avec une poche d’air adéquate ne peut que soutenir a. tumefaciens croissance pour un maximum de ~ 24 h. Si plus de Time-lapse séquences sont nécessaires, les autres approches telles que les cellules microfluidique ou le débit sont à considérer. Si les cellules dérivent hors de discussion pendant la formation image, assurez-vous que le coussin de gel d’agarose est plane et correctement scellé sous la lamelle. Notez que même avec un gel d’agarose parfait proche pad, il est possible que certaines cellules vont dériver hors foyer, imagerie ainsi plusieurs champs et recentrage fréquents sont fortement recommandés. Pour d’autres bactéries, les approches alternatives de la préparation des tampons d’agarose envisagera^41,42,43 pour répondre au mieux aux exigences de la croissance de la bactérie. Coussinets de gel d’agarose sont également utiles pour immobiliser des cellules au cours de l’imagerie de cellules marquées ou fixes lorsque Time-lapse n’est pas nécessaire. Dans ce cas, la lamelle d’étanchéité n’est pas nécessaires et autres approches pour construire des tampons d’agarose qui peuvent être conservés jusqu'à ce que plus tard peut être approprié de⁴³.

Dans l’ensemble, l’utilisation de colorants spécifiques à la cible et le Time-lapse microscopie peut éclairer sur les processus fondamentaux chez les bactéries. Ici, nous illustrons le modèle de fer à cheval habituelles de l’étiquetage avec la teinture lipophile 4-64 et la caractéristique polaire et septale marquage avec fluorescent-d-aminoacides dans a. tumefaciens. Observations de ces modèles dans a. tumefaciens sont compatibles avec la croissance polaire de cette bactérie⁴⁴ et il est probable que des études similaires peuvent révéler des informations concernant le patterning chez d’autres bactéries de la croissance. La conclusion que colorants cyanine comme Orange conviennent pour des études de microscopie Time-lapse¹⁰ (Figure 3) permettra des études attentives de morphologie nucléoïde au cours de la croissance des cellules souches de type sauvage et mutant. Imagerie des fluorochromes spécifiques à la cible au cours de l’appauvrissement d’une protéine essentielle peut fournir des observations clés pour déterminer la fonction de la protéine. Enfin, puisque beaucoup de ces colorants sont disponibles avec différentes propriétés spectrales, études l’utilisation simultanée de plusieurs étiquettes devraient permettre des aperçus de la coordination des processus essentiels au cours de la progression du cycle cellulaire.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous remercions Michael VanNieuwenhze (Université de l’Indiana) pour le don des FDAAs utilisée dans la Figure 2 et Figure 4. Nous remercions les membres du laboratoire brun pour vos commentaires lors de la préparation de ce manuscrit. La recherche en laboratoire brun sur la division et la croissance des cellules a. tumefaciens est pris en charge par la National Science Foundation (IOS1557806).