Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et

Ce protocole décrit une stratégie opto-génétique pour moduler l'activité de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire de Xenopus . Cette méthode permet l'activation réversible de la voie de signalisation MAPK dans la culture de cellules de mammifères et dans les organismes vivants multicellulaires, comme les embryons de Xenopus , avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

L'activité de la kinase est cruciale pour une pléthore de fonctions cellulaires, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, la migration et l'apoptose. Au début du développement embryonnaire, l'activité kinase est très dynamique et répandue dans l'embryon. Les approches pharmacologiques et génétiques sont couramment utilisées pour sondage des activités kinase. Malheureusement, il est difficile d'obtenir une résolution spatiale et temporelle supérieure en utilisant ces stratégies. En outre, il n'est pas possible de contrôler l'activité kinase de manière réversible dans les cellules vivantes et les organismes multicellulaires. Une telle limitation reste un goulet d'étranglement pour obtenir une compréhension quantitative de l'activité kinase pendant le développement et la différenciation. Ce travail présente une stratégie opto-génétique qui profite d'un système bicistronique contenant des protéines photoactivables Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) et le domaine N-terminal de l'hélice-hélice-hélice basique interagissant avec le cryptochrome (CIBN). ReversiL'activation de la voie de signalisation de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) est obtenue grâce à une translocation de protéines à médiation légère dans des cellules vivantes. Cette approche peut être appliquée aux cultures cellulaires de mammifères et aux embryons de vertébrés vivants. Ce système bicistronique peut être généralisé pour contrôler l'activité d'autres kinases avec des mécanismes d'activation similaires et peut être appliqué à d'autres systèmes modèles.

Les facteurs de croissance sont impliqués dans un large éventail de fonctions cellulaires, y compris la prolifération, la différenciation, la migration et l'apoptose, et jouent un rôle central dans de nombreux événements biologiques, y compris le développement embryonnaire, le vieillissement et la régulation de l'état mental ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . De nombreux facteurs de croissance signalent des cascades de signalisation intracellulaire complexes. Ces événements de signalisation sont souvent opérés par la phosphorylation réversible des protéines de manière réglementée ^{6 , 7} . Ainsi, une compréhension des résultats de signalisation des protéines kinases, qui sont responsables de la phosphorylation des protéines, est fondamentalement importante.

Différents facteurs de croissance agissent à travers un réseau de signalisation intracellulaire assez fréquent, bien qu'ils stimulent distRéactions cellulaires internes ^{8 , 9} . Les médiateurs intracellulaires communs des tyrosine kinases réceptrices comprennent Ras, Raf, la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK), la protéine kinase activée par un mitogène (MAPK) / ERK kinase (MEK), la phosphoinositide 3-kinase (PI3K), l'Akt et la phospholipase C gamma (PLCγ) ^{10 , 11} . Les données recueillies suggèrent que la diversité et la spécificité de la signalisation dépendent de la régulation spatiale et temporelle de l'activité de signalisation ¹² . Par exemple, dans les cellules de phéochromocytome de rat (PC12), la stimulation du facteur de croissance épidermique (EGF), qui entraîne une prolifération cellulaire, active de manière transitoire la voie ERK ⁹ . D'autre part, la stimulation avec le facteur de croissance nerveuse (NGF), qui conduit à la différenciation cellulaire, active la voie ERK de manière soutenue ^{9 , 13} . En cultureChez les neurones de l'hippocampe, la signalisation transitoire par le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) favorise l'essor primaire des neurites, tandis que la signalisation prolongée conduit à une augmentation de la dérivation des neurites ¹⁴ . Au début du développement embryonnaire, l'activité ERK phosphorylée est temporairement dynamique et est répandue dans l'embryon ⁶ . Un écran génétique récent lors de l'embryogenèse précoce de Xenopus a montré que les cascades de signalisation ERK et Akt, deux voies du facteur de croissance primaire en aval, affichent des profils d'activation spécifiques à l'étape ⁷ . Ainsi, une compréhension des résultats de la signalisation kinase nécessite des outils qui peuvent sonder les caractéristiques spatiales et temporelles de l'activité kinase avec une résolution suffisante.

Les approches expérimentales conventionnelles pour sonder la nature dynamique de la transduction du signal pendant le développement n'ont pas la résolution spatiale et temporelle souhaitable. Par exemple, les approches pharmacologiques utilisent une petite chemMolécules biologiques ou biologiques pour stimuler ou supprimer la transduction du signal dans les cellules et les tissus. La nature diffusive de ces petites molécules rend difficile de restreindre leur action à une région d'intérêt spécifique ¹⁵ . Les approches génétiques ( par exemple, la transgénèse, le système Cre-Lox ou la mutagenèse) conduisent souvent à une activation ou à une répression irréversible de l'expression du gène cible ou de l'activité protéique ^{16 , 17 , 18} . Le système Tet-On / Tet-Off ¹⁹ offre un contrôle temporel amélioré de la transcription des gènes mais manque de contrôle spatial strict car il repose sur la diffusion de la tetracycline. Les développements récents de la dimérisation des protéines chimiquement induites ²⁰ ou des photos ^{21 , 22 , 23 , 24} ont considérablement amélioréLe contrôle temporel des réseaux de signalisation. Le contrôle spatial, cependant, reste difficile en raison de la nature diffusive des produits chimiques en cage.

Les approches optogénétiques émergentes récentes, qui exploitent la puissance de la lumière pour contrôler les interactions protéine-protéine, permettent la modulation des voies de signalisation avec une haute précision spatio-temporelle ainsi qu'une réversibilité. Peu après son succès initial dans le contrôle des tirs neuronaux ^{25 , 26 , 27} , l'optogenèse a été étendue pour contrôler d'autres processus cellulaires, tels que la transcription des gènes, la traduction, la migration cellulaire, la différenciation et l'apoptose ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34} . Une stratégie utilisant la pLa combinaison de protéines hotoactivables La protéine de cryptochrome 2 d' Arabidopsis thaliana (CRY2) et le domaine N-terminal de l'hélice-boucle de base-hélice basique (CIBN) qui coopère avec le cryptochrome ont récemment été développés pour contrôler l'activité de Raf1 kinase dans des cellules de mammifères et des embryons de Xenopus ³⁵ . CRY2 se lie à CIBN lors de la stimulation de la lumière bleue, et le complexe de protéines CRY2 / CIBN se dissocie spontanément dans l'obscurité ³⁴ . La lumière bleue excite le cofacteur CRY2, le dinucléotide d'adénine de flavine (FAD), ce qui conduit à une modification conformationnelle de CRY2 et à sa liaison ultérieure à CIBN. Des mutants actifs actifs (W374A) et des déficients en flavine (D387A) de CRY2 peuvent être produits par des mutations dans la poche de liaison au FAD: le mutant CRY2 ^W374A se lie à CIBN indépendamment de la lumière, alors que le mutant CRY2 ^D387A ne se lie pas à la CIBN sous le bleu - stimulation lumineuse ^{36 , 37} . Le système opto-génétique décrit iN ce protocole utilise CRY2 et CIBN de type sauvage pour induire une activation de Raf1 médiée par translocation de protéines dans des cellules vivantes. On sait que le recrutement membranaire de Raf1 améliore son activité ³⁸ . Dans ce système, un module tandem CIBN est ancré à la membrane plasma et CRY2-mCherry est fusionné à la N-terminal de Raf1 ³⁵ . En l'absence de lumière bleue, CRY2-mCherry-Raf1 reste dans le cytoplasme et Raf1 est inactif. La stimulation à la lumière bleue induit la liaison CRY2-CIBN et recrute Raf1 à la membrane plasmatique, où Raf1 est activé. L'activation de Raf stimule une cascade de signalisation Raf / MEK / ERK. Les protéines de fusion CRY2 et CIBN sont codées dans un système génétique bicistronique. Cette stratégie peut être généralisée pour contrôler d'autres kinases, telles que Akt, dont l'état d'activation peut également être activé par la translocation des protéines dans les cellules ³⁹ . Ce travail présente des protocoles détaillés pour la mise en œuvre de cette stratégie optogénétique dans la culture de cellules de mammifèresRes et des organismes multicellulaires.

La recherche sur les animaux a été menée conformément aux lignes directrices établies par le Comité de l'établissement et de l'alimentation en établissement des animaux de l'Illinois (IACUC) et le Département des ressources animales de l'Université de l'Illinois (DAR).

1. Induction optogénétique de la localisation des protéines dans la culture cellulaire de mammifères BHK21

REMARQUE: Les étapes 1.1-1.3 fournissent une méthode pour assembler une cellule de culture cellulaire pour l'imagerie avec des objectifs de grossissement élevé ( par exemple, 63X ou 100X), qui ont généralement de courtes distances de travail. Ces objectifs nécessitent une fine lamelle de verre ( par exemple, 1,5 pouce d'épaisseur de 170 μm) en tant que substrat d'imagerie. Alternativement, on peut utiliser un plateau / glissière de culture de fond en verre. Dans un tel cas, les étapes 1.1-1.3 peuvent être ignorées.

1. Nettoyage des lamelles de verre
   1. Placez des lamelles en verre dans un porte-lamelle.
   2. Dans un bécher en plastique de 600 ml, ajouter 20 g de détergent et 400 ml d'eau chaude au robinet. PlacE le bécher sur un agitateur magnétique et remuer jusqu'à ce que tout le détergent soit dissous. Retirer la mousse à l'aide de papier de soie.
   3. Utilisez le fond d'une boîte de Petri de 100 mm x 15 mm comme espaceur de la barre d'agitation et comme surface pour le porte-lamelle. Pour maintenir un débit adéquat pendant le processus de nettoyage, faites 3-4 trous de vidange dans la boîte de Petri.
   4. Pour faire les trous de vidange, chauffer un fer à souder et brûler à travers le plastique dans un capot ventilé.
      ATTENTION: Ne pas toucher le fer à souder chauffé à mains nues.
   5. Placez le porte-lamelle sur la boîte de Petri dans le bécher. Mélanger pendant 2 heures jusqu'à la nuit à température ambiante.
   6. Laver trois fois avec 500 mL d'eau DI dans un bécher de 1000 mL. La solution de détergent peut être réutilisée.
   7. Ramassez les lamelles individuelles à l'aide d'une pince. Immergez les lamelles dans l'éthanol à 190 épreuves (95%) pendant 1 min.
   8. Séchez les lamelles à l'intérieur d'un capuchon stérile. Rangez les lamelles dans un récipient en plastique stérile jusqu'à l'utilisation.
2. Fabriquer des lamelles revêtues de poly-L-lysine (PLL)
   1. Faire un tampon de borate 0,1 M en dissolvant 1,24 g d'acide borique et 1,9 g de tétraborate disodique dans 400 ml d'eau. Ajuster le pH à 8,5 avec du NaOH 10 M.
   2. Dissoudre PLL dans le tampon de borate jusqu'à une concentration finale de 1 mg / mL. Aliquotez la solution de PLL dans des tubes centrifuges stériles de 50 ml.
   3. Ajouter 50 ml de solution de revêtement PLL dans un plat de culture de tissu de 10 cm. Placer le plat dans un incubateur à 37 ° C pour réchauffer la solution PLL.
   4. Ouvrez le conteneur de lamelle (étape 1.1.8) dans un capot stérile.
   5. Immergez les lamelles nettoyées une par une dans la solution de PLL préchauffée dans le plat de culture de tissus. Évitez la formation de bulles afin d'immerger toutes les surfaces.
   6. Placez le plat avec la lamelle coulissante dans un incubateur de CO _{2 de} 37 ° C toute la nuit. Retirez chaque lamelle et placez-le dans un porte-lamelle stérile. Rincer trois fois avec de l'eau ultrapure autoclavée (18,2 MΩ et #183; cm de résistivité) dans un bécher de 1000 ml dans une hotte stérile.
   7. Séchez les lamelles dans le porte-lamelle dans le capot stérile. Rangez les lamelles dans un récipient en plastique stérile jusqu'à l'utilisation.
3. Assemblage de cellules de culture cellulaire de polydiméthylsiloxane (PDMS)
   1. Dans un récipient en plastique, peser 40 g de base PDMS et ajouter 4 g d'agent de durcissement pour obtenir un rapport 10: 1 p / p de PDMS et agent de durcissement. Mélanger le PDMS / agent de durcissement en remuant avec une pointe de pipette pendant 2 min. Alternativement, utilisez un mélangeur centrifuge.
   2. Utilisez un bécher avec un diamètre de 4 pouces en tant que modèle pour fabriquer un support avec une feuille d'aluminium. Placez le support en aluminium dans une boîte de Petri de 15 cm. Placez une plaquette de silicium de 4 pouces dans ce support en aluminium.
   3. Verser la solution PDMS mélangée dans le support. Utilisez une fine tige en verre pour toucher doucement le bord de la plaquette. Retirez les bulles d'air piégées sous la plaquette.
   4. Insérez la boîte de Petri de 15 cm dans un chambe sous videR pour dégager la solution PDMS. Continuer le dégazage pendant environ 20 minutes, jusqu'à ce qu'aucune bulle ne soit générée. En attendant, préchauffer un four à convection à 65 ° C.
   5. Placez soigneusement la boîte de Petri de 15 cm dans le four. Incuber pendant 2 h.
   6. Retirez la plaque du four. Utilisez une barre de verre pour toucher doucement le bord du PDMS et assurez-vous une réticulation complète. Sinon, incuber plus longtemps, jusqu'à ce que le PDMS soit solide et non collant.
   7. Retirez le film d'aluminium de la plaque et éloignez-la de la plaquette de silicium. À partir du bord, éplucher soigneusement le PDMS duré de la plaquette de silicium.
      ATTENTION: Évitez d'appliquer trop de force, puisqu'il peut casser la gaufrette.
   8. Coupez le PDMS dans des pièces rectangulaires de 20 mm x 30 mm pour ajuster la lamelle de 24 mm x 40 mm avec une lame de rasoir.
   9. Utilisez une lame en forme de ciseau pour couper une ouverture rectangulaire de 10 mm x 20 mm du centre de chaque pièce PDMS.
   10. Nettoyer les chambres PDMS en utilisant le protocole détergent décrit à l'étape 1.1.
   11. Séchez les chambres PDMS dans un capot propre. Placez les chambres sèches dans un récipient autoclavable recouvert de papier d'aluminium.
   12. Enclenchez le récipient à l'aide de la gravité (121 ° C, 15 psi) pendant 30 minutes et rangez le récipient à température ambiante.
4. Culture et transfection des cellules BHK21
   1. Faire 500 mL de milieu pour la culture de cellules BHK21 en mélangeant 445 ml de DMEM avec 50 mL de FBS et 5 mL de Penn-Strep-Glutamine 100 × (10 000 U / mL de pénicilline, 10 mg / ml de streptomycine et 29,2 mg / mL de L -glutamine). Assurez-vous que la concentration finale de FBS est de 10%.
   2. Aliquote 10 ml de milieu indépendant de HEPES CO ₂ pour l'imagerie des cellules vivantes.
      NOTE: Le milieu indépendant de CO ₂ supporte la croissance cellulaire sans incubateur de CO ₂ et est idéal pour imager des cellules dans des conditions atmosphériques. Reportez-vous à la liste des matériaux pour obtenir des informations détaillées. En plus de la lignée cellulaire BHK21, d'autres types de cellules de mammifères devraient également donnerDes résultats similaires.
   3. Assembler un dispositif de culture cellulaire en plaçant une chambre PDMS stérilisée autoclavée (étape 1.3) sur une lamelle stérile revêtue de PLL (étape 1.2) dans une hotte stérile.
   4. Placez chaque appareil dans une boîte de Petri stérile de 60 mm.
   5. Utiliser 0,5 ml de trypsine à 0,25% pour détacher les cellules d'un puits d'une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Compter la densité cellulaire avec un hémocytomètre. Placer 20 000 cellules BHK21 dans la chambre (environ 10 000 cellules / cm ² ) avec 200 μL de milieu de culture cellulaire.
   6. Préparer un plasmide d'ADN avec un kit de préparation de plasmide (voir la Liste des matériaux).
      REMARQUE: La conception et la fonctionnalité du CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX sont illustrées à la Figure 1A - 1B .
   7. Vingt-quatre (24) h après le placage cellulaire, transfectent les cellules avec 50-100 ng de plasmide CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX, selon le protocole du fabricant.
   8. Trois (3) heures après la transfection, changez le mÀ 200 μL de milieu de culture frais (étape 1.4.1) et permettent aux cellules de se rétablir pendant la nuit en incubant la culture dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO ₂ .
5. L'imagerie par cellule vive en fluorescence
   1. Allumez un ordinateur, une source lumineuse, un microscope et une caméra. Utilisez un microscope à fluorescence confocale (équipé d'un objectif d'immersion en huile 100X) pour le reste du protocole.
      NOTE: Un microscope à épifluorescence inversée peut également être utilisé.
   2. Remplacer le milieu de culture cellulaire avec 200 μL de milieu indépendant de CO ₂ .
   3. Configurez le protocole d'acquisition de données avant de placer les cellules sur le microscope. Utilisez un canal FITC d'excitation de 488 nm pour la stimulation optogénétique. Utilisez un canal TRITC d'excitation de 561 nm pour localiser les cellules transfectées et suivre la localisation cellulaire des protéines marquées par mCherry.
   4. Réglez le gain des canaux FITC et TRITC comme 120 et 200, respectivement. Utilisez un temps de pixel de 2.21; s et une taille de 512 x 512 pixels.
   5. Mesurez la puissance de la lumière de 488 nm en plaçant un compteur de puissance à proximité de la fenêtre d'objectif. Une puissance totale de 2 μW (environ 10 000 W / cm ² au foyer) est suffisante pour induire une association CIBN-CRY2PHR.
   6. Mettre en place une acquisition d'horodatage avec un intervalle de 5 s et un temps d'acquisition total de 2 min.
   7. Appliquez un matériau d'appariement approprié (huile d'immersion) sur la fenêtre d'objectif. Utilisez le mode de contraste de phase pour se concentrer sur les cellules sur la surface de la lamelle.
   8. Localiser une cellule transfectée sous une lumière de 561 nm en déplaçant le stade du microscope.
      ATTENTION: Évitez d'utiliser la lumière bleue pendant cette étape, car elle active l'association entre les protéines photoactivables.
   9. Une fois qu'une cellule transfectée est située, lancez l'acquisition de données.
      NOTE: Les cellules transfectées avec succès doivent présenter une fluorescence dans les canaux FITC (à partir de 2CIBN-GFP-CaaX) et TRITC (à partir de CRY2-mCherry-Raf1) ( Figure 1C-D ).
   10. Enregistrez une série d'images estampillées dans les deux canaux FITC et TRITC ( Figure 1D ).
   11. Pour sonder la dissociation spontanée du complexe de protéines CRY2-CIBN, enregistrez un autre timestamp avec le canal Txred seul pendant 20 min, avec un intervalle de 30 s.
   12. Enregistrez l'image timbrée pour l'analyse des données.
6. L'analyse d'image
   1. Ouvrez les images avec un logiciel d'analyse d'image qui peut extraire l'intensité d'une image ⁴⁰ .
   2. Sélectionnez deux instantanés représentatifs: un avant l'exposition à la lumière bleue et l'autre exposition post-lumière bleue.
   3. Dessinez une ligne à travers la cellule couvrant l'arrière-plan, la membrane plasmique et le cytoplasme. Expliquez l'intensité sur cette ligne. Enregistrez les valeurs et traitez-les pour comparer la différence avant et après l'exposition à la lumière ( Figure 1D ).
   4. Pour analyser la cinétique de l'association des protéines, sélectionnezT une région représentative d'intérêt (ROI) dans la membrane plasmatique, un ROI dans le cytoplasme et un ROI en arrière-plan.
   5. Acquérir les intensités moyennes de la membrane plasmatique (I _PM ), du cytoplasme (I _CYT ) et de l'arrière-plan (I _BKD ) pour la pile d'images.
   6. Calculer le rapport de l'intensité membranaire / cytosolique pour chaque image en utilisant l'équation suivante:
      
   7. Tracer le rapport par rapport au temps et déterminer la cinétique de liaison ou de dissociation de CRY2-CIBN ( Figure 1E- F ).

2. Construction d'une matrice LED pour la stimulation de la lumière à long terme dans un incubateur de CO ₂

REMARQUE: Le schéma global de l'installation expérimentale est illustré à la figure 2A .

1. Faites le tableau LED en insérant 12 LED bleues en deux panneauxDs et les résistances de limitation de courant de connexion.
   REMARQUE: avec une alimentation de 30 V, quatre LED peuvent être connectées en série et leur luminosité peut être contrôlée par une résistance de limitation de courant.
2. Placez les panneaux dans une boîte en aluminium.
   REMARQUE: La hauteur de la boîte en aluminium doit être de 2 po. Cette hauteur est optimale pour éclairer une plaque de culture de tissus à 12 puits, car la taille du spot lumineux divergent est identique à celle d'un seul puits.
3. Utilisez deux fils métalliques pour vous connecter à l'alimentation électrique. Assurez-vous que la longueur du fil est suffisante lorsque la boîte à lumière est placée dans un incubateur de CO ₂ .
4. Utilisez un diffuseur de lumière transparent comme le couvercle de la boîte à lumière ( Figure 2C ).
5. Calibrez la puissance de chaque LED à une gamme d'entrées de tension. Utilisez une puissance de 0,2 mW / cm ² pour le test de différenciation cellulaire PC12 24 h. Utiliser une puissance de 5 mW / cm ² pour les embryons ou les explants de Xenopus en directTests.

3. Induction optogénétique de la différenciation cellulaire PC12

1. Culture cellulaire et transfection
   1. Faire 500 ml de milieu pour une culture cellulaire de phéochromocytome de rat (PC12) en mélangeant 407,5 ml de F12K avec 75 ml de sérum de cheval + 12,5 ml de FBS + 5 ml de 100 × Penn-Strep-Glutamine (concentrations finales de sérum de cheval et FBS : 15% et 2,5%, respectivement). Faire un faible milieu sérique en mélangeant 1 volume de milieu complet dans 99 volumes de milieu F12K.
   2. Placer les cellules PC12 dans une plaque de 12 puits à une densité de 300 000 cellules / puits ou 75 000 cellules / cm ² .
   3. Transférez les cellules avec CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 h après le placage cellulaire (similaire à l'étape 1.4.7). Utiliser 1,2 μg d'ADN pour chaque puits. Autoriser les cellules à se rétablir pendant une nuit dans un milieu de culture dans un incubateur à 37 ° C complété par 5% de CO ₂ . Vérifier l'efficacité de transfection 16 h après la transfection.
      REMARQUE: une transfection de 30 à 50%Il conviendrait d'assurer un nombre suffisant de cellules.
   4. Changer le milieu à faible teneur en sérum 24 h après la transfection. Utiliser 1 ml de milieu par puits d'une assiette à 12 puits.
2. Différenciation cellulaire PC12 induite par la lumière
   1. Placez le tableau LED dans un incubateur de CO ₂ . Connectez-le à l'alimentation en utilisant une paire de fils. Réglez la puissance de la LED à 0,2 mW / cm ² . Placez la plaque de 12 puits contenant des cellules PC12 transfectées (étape 3.1.3) sur la fenêtre de la matrice LED. Appliquer l'éclairage continu de la lumière pendant 24 h dans un incubateur à 37 ° C complété par 5% de CO ₂ .
3. Imagerie par cellule vive en fluorescence
   1. Suivez les étapes 1.5.1-1.5.4 pour le microscope et la préparation de l'échantillon.
   2. Configurer l'acquisition de données à une seule capture. Utilisez 200 ms pour le canal GFP et Txred.
   3. Capturez les images des cellules transfectées dans les deux canaux GFP et Txred. Enregistrez environ 200 celC'est pour chaque condition. Enregistrez les fichiers pour l'analyse des données.
4. L'analyse d'image
   1. Comptez le pourcentage de cellules différenciées sur le nombre total de cellules transfectées.
   2. Utilisez le module de comptage de cellules dans le logiciel d'analyse d'image pour compter les cellules.
   3. Comptez manuellement les cellules différenciées.
      NOTE: Les cellules différenciées sont définies comme celles dans lesquelles au moins un neurite est discernablement plus long que le corps de la cellule ( Figure 3A- 3B ).
   4. Répétez l'étape 3.4.3 avec des cellules indifférenciées.
   5. Calculez le taux de différenciation en utilisant l'équation suivante:
      

4. Contrôle optogénétique de l'activité de la kinase chez les embryons de Xenopus

1. Préparation des tampons
   1. Préparez 1 L de 1x Timer Modifié Marc (MMR): 100 mMNaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 et 5 mM de HEPES; PH 7,5.
2. Préparation de l'ARNm
   1. Recréer l'ADN plasmidique CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX (2 μg) avec 1 μL d'ApaI (50 unités) à 37 ° C pendant 2 h.
   2. Précipiter l'ADN linéarisé dans 60 μL d'éthanol à 100%. Tourner à 12 000 × g pendant 5 minutes à température ambiante pour granuler l'ADN. Retirez soigneusement le surnageant et lavez encore le culot avec 60 μL d'éthanol à 70%. Faire tourner à 12 000 × g pendant encore 5 minutes à température ambiante. Retirez avec précaution le surnageant et remettez à nouveau le culot d'ADN dans 6 μl de H20 libre de RNase.
   3. Effectuer la transcription in vitro en incubant 1 μg d'ADN linéarisé avec 2 μl d'ARN polymérase SP6 fournie, un mélange de ribonucléotides (ATP 10 mM, CTP et UTP, GTP 2 mM et analogue de capuchon 8 mM) et 20 μL de nuclease- Eau libre à température ambiante pendant 1 h.
   4. Supprimer le DModèle NA par digestion par DNase I à 37 ° C pendant au moins 15 min et purification de l'ARN synthétisé à l'aide d'une colonne de spin de silice-membrane.
   5. Arrêter la réaction et précipiter l'ARN en ajoutant 30 μL d'eau exempte de nuclease et 30 μL de solution de précipitation au LiCl. Bien mélanger et refroidir pendant 30 min à -20 ° C.
   6. Centrifuger à 4 ° C pendant 15 min à 12 000 × g pour granuler l'ARN.
   7. Retirez soigneusement le surnageant. Laver l'ARN une fois avec 1 mL d'éthanol à 70% et ré-endiguer dans 40 μL d'eau exempte de nuclease.
   8. Chargez 40 μL d'ARN dans une colonne de spin. Centrifuger à 4 ° C pendant 1 min à 12 000 × g pour éliminer les nucléotides et capsules non incorporés.
3. Récolter des embryons de Xenopus
   1. Suivez le protocole décrit par Sive et al. ⁴¹ pour obtenir les embryons de Xenopus .
4. Micro-injection d'ARNm
   1. FabriquerLes aiguilles pour la micro-injection en tirant des capillaires en verre avec un extracteur capillaire. Réglez le programme de traction sur: chaleur = 355, force de tirage = 80, vitesse = 50 et temps = 100.
   2. Retirez la couche de gelée des embryons en les traitant avec 3% de cystéine (diluée dans 0,2x MMR).
   3. Transférer les embryons à 3% de polysucrose et à solution de MMX 0.5x pour microinjection. Injecter 500 pg à 1 ng d'ARN CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX dans chaque embryon.
      REMARQUE: l'injection d'une dose supérieure à 1 ng entraîne une activation de la signalisation MAPK indépendante de la lumière bleue.
5. La stimulation optogénétique de l'activité kinase
   1. Culture des embryons micro-injectés dans 3% de polysucrose, solution de MMR 0,5x à température ambiante jusqu'à ce qu'elles atteignent le stade de la moyenne des gaztrules (étape 12). Ensuite, culturez les embryons dans une solution de MMR 0,2x.
   2. Transférer les embryons ou les explants dans une assiette de 12 puits. Placez la plaque à 12 puits sur la matrice LED à la maison (étape 2.5) pour la lumière bleueT (475 nm) de traitement.
   3. Placez un miroir sur le dessus de la plaque à 12 puits pour assurer un éclairage bleu clair des embryons ou des explants.
   4. Réglez la puissance de la lumière bleue à 5 mW / cm ² .
      REMARQUE: Le traitement à la lumière bleue peut être effectué à n'importe quel moment souhaité, soit en polysucrose à 3%, en solution de MMX 0,5x, soit en solution de MMR 0,2x.
   5. Récolte les embryons à tout moment souhaité. Utilisez-les pour une analyse histologique, Western-blot ou d'expression de gènes.

L'expression ratiométrique des paires de protéines photoactivables: la figure 1A montre la conception d'une construction optogénétique bicistronique, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (appelée CRY2-2A-2CIBN), basée sur le teschovirum porcine- 1 2A (P2A) peptide, qui montre l'efficacité de saut de ribosome le plus élevé parmi les lignées de cellules de mammifères ⁴² . Dans les travaux antérieurs, il a été déterminé que le ratio optimal pour CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 est 2: 1 ³⁵ . Cette configuration permet un recrutement suffisant de membrane et l'activation de CRY2-mCherry-Raf1 ( Figure 1B ). Les cellules transfectées individuellement avec CRY2-2A-2CIBN montrent une fluorescence claire dans les canaux fluorescents GFP et Txred, soit sous epi-illumination ( Figure 1C ), soit en microscopie confocale ( Figure 1D ). Mémoire à médiation légère bleueLe recrutement de CRY2-mCherry-Raf1 ( figure 1D ) peut être clairement détecté en microscopie confocale. L'association se produit en quelques secondes après l'exposition à la lumière bleue ( figure 1E ) et le complexe protéique CRY2-CIBN se dissocie avec une demi-vie d'environ 5,5 min ( figure 1F ).

La différenciation des cellules PC12 contrôlée par la lumière en l'absence de facteur de croissance nerveuse: une observation intrigante dans la signalisation du facteur de croissance est que les voies communes de signalisation en aval ( p. Ex. ERK, PI3K-Akt et PLCγ) suscitent la diversité et la spécificité dans les réponses de signalisation. Une meilleure compréhension de la signalisation par facteur de croissance peut être obtenue en permettant une technologie permettant une régulation spatiotemporelle précise des cascades individuelles. L'approche opto-génétique introduite dans ce protocole démontre une telle technologie qui permet l'activatio spécifiqueN de la voie de signalisation Raf / MEK / ERK avec une résolution temporelle élevée. Parce que cette approche contourne le processus de liaison de NGF à ses récepteurs membranaires, la cinétique de signalisation ne dépend plus des récepteurs endogènes. Au lieu de cela, un contrôle cinétique précis peut être réalisé en modulant le profil temporel de la lumière stimulante ( Figure 2A ). Ainsi, cette approche ouvre de nouvelles possibilités d'étude de la cinétique de signalisation de l'activité kinase. De plus, cette configuration expérimentale offre un moyen extrêmement simple et économique d'intégrer l'approche opto-génétique aux études de transduction du signal intracellulaire ( Figure 2B -2D ). Pour le test de différenciation cellulaire PC12, une stimulation à la lumière continue de 24 h à 0,2 mW / cm ² est suffisante pour induire une croissance significative des neurites ( Figure 3A ). Contrôles négatifs, y compris les cellules transfectées sans lumière ( Figure 3B) et les cellules non transfectées avec ou sans lumière ( Figure 3C -3D ), ne montrent pas une croissance significative des neurites. À cette puissance, les cellules transfectées avec un Raf1 constitutivement actif (CA-Raf1) subissent une différenciation normale ( Figure 3E ). Notamment, les cellules transfectées avec la construction optogénétique bicistronique produisent un taux de différenciation significativement plus élevé que les cellules co-transfectées avec deux constructions, atteignant la valeur induite par CA-Raf1 ( Figure 3F ). Le rapport de différenciation est calculé en divisant le nombre de cellules différenciées par le nombre de cellules transfectées guidées par fluorescence GFP. Les cellules différenciées sont définies comme celles avec au moins un neurite plus long que la taille du corps cellulaire ³⁵ . Cette amélioration du rapport de différenciation découle de: 1) une meilleure livraison des protéines photoactivables avec le système bicistronique et 2) une opTaux d'expression timatéral entre CIBN et CRY2 ³⁵ .

La stimulation optogénétique réversible de la voie de signalisation Raf / MEK / ERK dans les embryons vivants de Xenopus laevis : X. laevis est un organisme modèle bien établi pour l'étude de la transcription des gènes, de la transduction du signal et du développement embryonnaire. Des travaux antérieurs ont révélé que l'activation de la voie Raf / MEK / ERK conduit à un changement de destin de la cellule, ce qui a entraîné la formation d'une structure ectopique en forme de queue au niveau de la nuque ⁴³ . En tant que inducteur de mésoderme puissant, Raf1 surexprimé peut induire le mésoderme ectopique pendant la spécification de la couche germale, qui se produit pendant la blastula et les premiers stades de gastrula, et entraînent la formation de structures ectopiques en queue plus tard. Alternativement, Raf1 surexprimé peut déclencher un événement épithélial-mésenchymateux (EMT) après la spécification de la couche germale a été complété et peut directementTransformez l'ectoderme en lignées neuronales et mésodermiques. Ceci est suivi par la prolifération et l'extension de ces structures ⁴³ . Dans ces expériences, les ARN codant pour le récepteur MET, Ras et Raf1 ont été injectés dans des embryons au stade à deux cellules. Peu de temps après l'injection de l'ARN dans l'embryon, le MET / Ras / Raf1 surexprimé a commencé à activer de façon constitutive les cascades de signalisation en aval. Par conséquent, il était techniquement difficile de contourner les premiers stades de développement et d'activer Raf1 spécifiquement après la spécification de la couche germale. Il était impossible d'utiliser une telle stratégie pour déterminer si l'activation de la signalisation Raf / MEK / ERK après la spécification de la couche germale entraînerait un changement de sort de la cellule, ce qui entraînerait la formation d'une structure ectopique en forme de queue.

L'optogenèse fournit un mécanisme pour contrôler le moment de l'activité Raf1. Lorsque l'ARN de CRY2-2A-2CIBN a été injecté dans des embryons au stade de développement précoceS, Raf1 est resté inactif jusqu'à ce que la lumière bleue soit fournie. Le test du cap animal a été utilisé de manière pratique pour caractériser le résultat de la signalisation, car l'activité ERB basale est faible chez les animaux. L'activation médiée par la lumière de la cascade de signalisation Raf / MEK / ERK a induit une régulation positive significative du xbra, un marqueur mésodermique, déterminé par la RT-PCR ( Figure 4A ) ou l'hybridation in situ intégrée ( figure 4B ). Des changements dynamiques dans la phosphorylation d'ERK en réponse à la lumière bleue ont également été détectés par l'analyse Western-blot ( Figure 4C ). Dans les embryons entiers, un mélange d'ARN CRY2-2A-2CIBN et n-β-gal a été injecté au stade 8 cellules dans l'un des blastomères animaux dorsaux, qui plus tard engendre un tissu antérieur dorsal. Par rapport aux embryons non traités ( Figure 4D -4E ), ceux injectés avec CRY2-2A-2CIBN et traités avec de la lumière bleue pourDes structures ectopiques de queue ( Figure 4F -4G ). Les embryons injectés dans l'obscurité ( Figure 4H ) ou non injectés sous l'éclairage de la lumière bleue ( Figure 4I ) ne formaient pas de structure semblable à la queue. L'illumination à la lumière bleue après la spécification de la couche germale a induit des structures importantes de queue ( Figure 4J ).

Figure 1: Le mécanisme de la localisation des protéines induites par la lumière et l'activation de la voie de signalisation de la kinase. ( A ) Conception d'une construction bicistronique, avec un rapport CIBN-à-CRY2 optimisé (2 CIBN: 1 CRY2) qui permet l'activation induite par la lumière de la voie de signalisation Raf / MEK / ERK kinase. Sur le saut ribosomique, un transcript de l'ARNm génère deux protéines: CRY2-mCherry-Raf1-N2A (finissantAvec NPG d'acides aminés) et proline-2CIBN-GFP-CaaX. ( B ) La liaison induite par la lumière entre CIBN et CRY2 conduit au recrutement par membrane de CRY2-mCherry-Raf1, qui active la voie de signalisation Raf / MEK / ERK. ( C ) Images fluorescentes de cellules BHK21 transfectées avec CRY2-2A-2CIBN sous epi-illumination. Barre d'échelle: 20 μm. ( D ) Imagerie par fluorescence confocale de cellules transfectées avec CRY2-2A-2CIBN. Le panneau de gauche montre 2CIBN-GFP-CaaX clivé localisé sur la membrane plasmatique; Le panneau central montre un instantané de CRY2-mCherry-Raf1 avant la stimulation de la lumière bleue; Le panneau de droite montre un instantané de CRY2-mCherry-Raf1 après 10 impulsions de stimulation de lumière bleue. Le panneau inférieur affiche des profils d'intensité normalisés le long d'une ligne pointillée jaune à travers la cellule, avant et après la stimulation de la lumière. Barre d'échelle = 20 μm. ( E - F ) Cinétique pour association CRY2-CIBN induite par la lumière ( E ) et dissociation spontanéeN ( F ) du complexe de protéines CRY2-CIBN dans l'obscurité. La figure 1A- B a été adaptée à partir de la référence ³⁵ , reproduite avec l'autorisation de la Société des biologistes. La figure 1E -F a été adaptée à partir de la référence ⁴⁴ sous la licence Creative Commons Attribution (CC BY). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Conception et étalonnage de la matrice LED à la maison. ( A ) Schéma de la configuration expérimentale pour l'activité kinase contrôlée par la lumière dans les cellules vivantes. ( B ) Planche de circuit pour le tableau à LED construit à la maison. ( C ) A ligHt box qui peut être utilisé pour la stimulation de la lumière à long terme dans un incubateur de CO ₂ . La hauteur de la boîte en aluminium est de 2 po ( D ) Puissance de sortie LED typique en fonction de la tension. Valeur de la puissance de la lumière par LED dans un circuit dans lequel une résistance de limitation de courant et quatre LED sont connectées en série. La figure 2A a été adaptée à partir de la référence ³⁵ , reproduite avec l'autorisation de la Société des biologistes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Induction optogénétique de la différenciation cellulaire PC12. ( A ) Instantanés multicanaux de cellules PC12 transfectées avec CRY2-2A-2CIBN après 24 h de stimulation par lumière bleue (0,2 mW / cm ² ). A cIrcle marque une cellule différenciée. Un carré marque une cellule indifférenciée. ( B ) Identique à ( A ), sauf qu'aucune stimulation à la lumière bleue n'a été utilisée. ( C - D ) Cellules PC12 non transfectées sous 24 h de stimulation de lumière bleue (0,2 mW / cm ² ) ( C ) ou incubation sombre ( D ). ( E ) Images représentatives de cellules transfectées avec Raf1-GFP-CaaX (CA-Raf1). Le cercle et le rectangle marquent des cellules différenciées et indifférenciées, respectivement. ( F ) Ratios de différenciation des cellules PC12 transfectées avec CA-Raf1, co-transfectées avec CRY2-mCherry-Raf1 et CIBN-GFP-CaaX, et transfectées individuellement avec CRY2-2A-2CIBN. 24 h après la transfection, les cellules ont été exposées à la lumière ou incubées dans l'obscurité pendant encore 24 h. Les valeurs représentent la moyenne ± SD à partir de quatre ensembles de données indépendants. Seules les cellules exposées à la lumière bleue ont montré une différenciation significative. Figure 3FA été adapté à partir de la référence ³⁵ , reproduit avec l'autorisation de la Société des Biologistes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Induction optogénétique de l'activité kinase chez les embryons Xenopus vivants. ( A ) Les résultats de la RT-PCR montrant que l'exposition à la lumière bleue a induit l'expression de xbra, un marqueur pan-mésodermique, dans des capuchons d'animaux injectés par CRY2-2A-2CIBN au début de la phase de gastrula. ( B ) hybridation in situ intégrée du xbra dans les embryons. L'activation induite par la lumière de l'activité MAPK module la répartition spatiale du xbra (flèches rouges dans le panneau inférieur droit). Les flèches noires marquent le nucléaire β-gaLactosidase comme traceur de lignée. AP: pote animal. VP: pôle végétal. ( C ) Analyse Western-Blot montrant que, dans un test de capuchon animal, CRY2-2A-2CIBN a induit une phosphorylation réversible dépendant de la lumière bleue de ERK. ( D ) Images montrant la morphologie des embryons normaux, sans injection d'ARNm et sans traitements légers. ( E ) Une image agrandie d'un seul embryon. ( F - G ) Images agrégées et entières pour les embryons injectés avec ARNm CRY2-2A-2CIBN et soumises à une stimulation par lumière bleue. L'activation de Raf1 en traitant les embryons injectés par CRY2-2A-2CIBN avec de la lumière bleue induit des structures ectopiques en forme de queue dans la région de la tête. ( H - I ) Contrôles négatifs, y compris les embryons injectés avec CRY2-2A-2CIBN mais sous incubation sombre ( H ) et embryons non injectés sous stimulation par la lumière ( I ). Toutes les expériences de stimulation de lumière ont été réalisées avec une puissance de 5 mW / cm ^{2. ( J ) Analyse statistique du pourcentage d'embryons présentant une structure ectopique en forme de queue sous chaque condition. Barre d'échelle = ( D ) et ( G ): 1 mm; ( E - F ) et ( H - I ) 0,5 mm. Les figures 4A , C , E - F et H - J ont été adaptées à partir de la référence 35 , reproduites avec la permission de la Société des biologistes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.}

Lors de la construction de la boîte à lumière, la puissance des LED individuelles doit être mesurée. Sur la base de l'expérience précédente, la puissance de sortie peut varier entre les LED individuelles en raison de la variance de fabrication. Sélectionnez un ensemble de LEDs ayant une puissance inférieure à 10% l'une de l'autre. Le nombre de diodes électroluminescentes, la résistance de limitation de courant et l'entrée de puissance peuvent être modifiés pour différents types de conteneurs de culture cellulaire ( par exemple, une plaque de 6 puits ou de 24 puits). Un effet de lumière de 24 h à une puissance de 0,2 mW / cm ² n'induit pas une phototoxicité détectable ⁴⁴ . Si une puissance plus élevée est utilisée, envisagez d'utiliser une lumière intermittente pour réduire la production de chaleur et la phototoxicité. Le système opto-génétique introduit dans ce protocole induit une croissance des neurites dans les cellules PC12 sous stimulation intermittente de la lumière comparable à celle de la stimulation continue de la lumière, étant donné que l'intervalle sombre entre les deux impulsions lumineuses adjacentes est inférieur à 45 min ⁴⁴ . DûAux différences intrinsèques dans la cinétique de l'association et de la dissociation des protéines, la durée entre les impulsions lumineuses doit être accordée pour chaque paire de protéines unique. La surexpression du cytosolique Raf1 ne provoque pas de différenciation cellulaire PC12 sans éclairage bleu. En contrôlant la quantité d'ARNm injectée dans chaque embryon, aucun phénotype embryonnaire important n'a été observé dans l'obscurité.

Bien qu'une lumière bleue de faible puissance soit suffisante pour stimuler l'association des protéines de fusion CRY2 et CIBN, la faible profondeur de pénétration de la lumière bleue limite son utilisation dans la stimulation des tissus profonds. Bien qu'une telle stimulation ait été obtenue en fournissant de la lumière par d'autres dispositifs ( p. Ex. Fibre optique), les approches sont invasives ⁴⁵ . Ce problème peut être abordé de deux façons: en utilisant une paire de protéines qui répond à une longueur d'onde plus longue ( par exemple, la paire de protéines phytochrome-PIF6) ou en utilisant une excitation à deux photons. Les deux approches peuvent fournir deepeR pénétration, mais ils pourraient souffrir d'autres limitations. Par exemple, la paire PhyB-PIF6 nécessite un cofacteur synthétique, et la microscopie à deux photons nécessite une instrumentation coûteuse. Le manque d'accordabilité dans l'interaction CRY2-CIBN est une autre limitation à considérer. Le CRY2 de type sauvage se dissocie spontanément de CIBN avec une demi-vie de 5,5 min dans l'obscurité ³⁴ . Selon la cinétique de la voie de signalisation cible, une demi-vie de dissociation raccourcie ou prolongée peut être préférée. Des mutations dans CRY2 ont été faites qui peuvent raccourcir la demi-vie de dissociation à 2,5 min (W349R) ou la prolonger à 24 min (L348F) ⁴⁶ . Alternativement, les paires de protéines photovoltaïques conçues à base de récepteurs fongiques Vivid (VVD) et p / nMagFast1 et 2 montrent une demi-vie de dissociation de 4,2 min et 25 s, respectivement ⁴⁷ . Dans ce protocole, la paire de protéines CRY2-CIBN de type sauvage active la voie MAPK dans les 5 min de lumièreEt l'activité se désintègre au niveau basal dans les 30 min dans les cellules de mammifères ⁴⁴ et 1-2 h dans les embryons de Xenopus ³⁵ . Pour le contrôle spatial, la microscopie confocale peut focaliser le laser bleu sur la taille d'un point de limite de diffraction d'environ 200 nm dans le plan de l'image. En ajustant la taille du diagramme de champ dans un microscope à épi-éclairage équipé d'une source lumineuse non cohérente, il est possible de limiter la taille de l'éclairage à environ 10 μm de diamètre. Les deux méthodes devraient être capables d'atteindre le contrôle subcellulaire de la stimulation optogénétique dans les cultures cellulaires.

La capacité de l'optogenèse à interroger de manière réversible la transduction du signal avec une résolution spatiale et temporelle élevée offre une opportunité entièrement nouvelle d'étudier la signalisation intracellulaire dynamique dans les cellules vivantes. Les résultats de ce protocole ont révélé que l'activation de Raf1 est principalement responsable de l'induction de la différenciation neuronale chez le PC12 cellules ⁴⁴ . La même voie entraîne également la formation de structures secondaires de queue dans le développement d'embryons de Xenopus . En contrôlant le moment de l'activation de Raf1, la structure en forme de queue peut être induite après le stade de formation de la couche germinale ³⁵ . La méthode LOVTRAP récemment décrite utilise deux protéines modifiées, Zdark et LOV2, qui se lient sélectivement l'une à l'autre seulement dans l'obscurité pour moduler la dissociation induite par la lumière d'une protéine d'intérêt (POI) ⁴⁸ . Contrairement à l'association protéine-protéine médiée par la lumière, qui est utilisée dans cette approche, LOVTRAP utilise la lumière pour induire la dissociation des protéines. Cette nouvelle modalité est plus souple pour moduler la localisation et l'activité des protéines dans les cellules vivantes. En sélectionnant soigneusement le mode d'activation dans une cascade de signalisation, il est possible de disséquer la transduction du signal de manière non conventionnelle. Par exemple, il est possible d'activer les récepteurs tyrosine kinases sans lIgG-récepteur ⁴⁹ ou pour induire un sous-ensemble de cascades de signalisation provoquées par un ligand ⁴⁴ . La stratégie rapportée ici peut être généralisée pour contrôler d'autres kinases, telles que Akt ³⁹ et GTPases ( p. Ex. Rho GTPase), dont les états d'activation peuvent également être activés par translocation de protéines. L'optogenèse continuera d'être appliquée aux organismes multicellulaires en direct, comme en témoignent les travaux récents portant sur le contrôle optogénétique de la localisation et de la signalisation des protéines dans les embryons de Drosophila ⁵⁰ , ^{51 , 52 , 53 , 54} et Xenopus ³⁵ .

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Ce travail a été soutenu par l'Université de l'Illinois à Urbana-Champaign (UIUC) et les National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).