Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Ce protocole décrit une stratégie opto-génétique pour moduler l'activité de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire de Xenopus . Cette méthode permet l'activation réversible de la voie de signalisation MAPK dans la culture de cellules de mammifères et dans les organismes vivants multicellulaires, comme les embryons de Xenopus , avec une résolution spatiale et temporelle élevée.
L'activité de la kinase est cruciale pour une pléthore de fonctions cellulaires, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, la migration et l'apoptose. Au début du développement embryonnaire, l'activité kinase est très dynamique et répandue dans l'embryon. Les approches pharmacologiques et génétiques sont couramment utilisées pour sondage des activités kinase. Malheureusement, il est difficile d'obtenir une résolution spatiale et temporelle supérieure en utilisant ces stratégies. En outre, il n'est pas possible de contrôler l'activité kinase de manière réversible dans les cellules vivantes et les organismes multicellulaires. Une telle limitation reste un goulet d'étranglement pour obtenir une compréhension quantitative de l'activité kinase pendant le développement et la différenciation. Ce travail présente une stratégie opto-génétique qui profite d'un système bicistronique contenant des protéines photoactivables Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) et le domaine N-terminal de l'hélice-hélice-hélice basique interagissant avec le cryptochrome (CIBN). ReversiL'activation de la voie de signalisation de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) est obtenue grâce à une translocation de protéines à médiation légère dans des cellules vivantes. Cette approche peut être appliquée aux cultures cellulaires de mammifères et aux embryons de vertébrés vivants. Ce système bicistronique peut être généralisé pour contrôler l'activité d'autres kinases avec des mécanismes d'activation similaires et peut être appliqué à d'autres systèmes modèles.
Les facteurs de croissance sont impliqués dans un large éventail de fonctions cellulaires, y compris la prolifération, la différenciation, la migration et l'apoptose, et jouent un rôle central dans de nombreux événements biologiques, y compris le développement embryonnaire, le vieillissement et la régulation de l'état mental 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . De nombreux facteurs de croissance signalent des cascades de signalisation intracellulaire complexes. Ces événements de signalisation sont souvent opérés par la phosphorylation réversible des protéines de manière réglementée 6 , 7 . Ainsi, une compréhension des résultats de signalisation des protéines kinases, qui sont responsables de la phosphorylation des protéines, est fondamentalement importante.
Différents facteurs de croissance agissent à travers un réseau de signalisation intracellulaire assez fréquent, bien qu'ils stimulent distRéactions cellulaires internes 8 , 9 . Les médiateurs intracellulaires communs des tyrosine kinases réceptrices comprennent Ras, Raf, la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK), la protéine kinase activée par un mitogène (MAPK) / ERK kinase (MEK), la phosphoinositide 3-kinase (PI3K), l'Akt et la phospholipase C gamma (PLCγ) 10 , 11 . Les données recueillies suggèrent que la diversité et la spécificité de la signalisation dépendent de la régulation spatiale et temporelle de l'activité de signalisation 12 . Par exemple, dans les cellules de phéochromocytome de rat (PC12), la stimulation du facteur de croissance épidermique (EGF), qui entraîne une prolifération cellulaire, active de manière transitoire la voie ERK 9 . D'autre part, la stimulation avec le facteur de croissance nerveuse (NGF), qui conduit à la différenciation cellulaire, active la voie ERK de manière soutenue 9 , 13 . En cultureChez les neurones de l'hippocampe, la signalisation transitoire par le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) favorise l'essor primaire des neurites, tandis que la signalisation prolongée conduit à une augmentation de la dérivation des neurites 14 . Au début du développement embryonnaire, l'activité ERK phosphorylée est temporairement dynamique et est répandue dans l'embryon 6 . Un écran génétique récent lors de l'embryogenèse précoce de Xenopus a montré que les cascades de signalisation ERK et Akt, deux voies du facteur de croissance primaire en aval, affichent des profils d'activation spécifiques à l'étape 7 . Ainsi, une compréhension des résultats de la signalisation kinase nécessite des outils qui peuvent sonder les caractéristiques spatiales et temporelles de l'activité kinase avec une résolution suffisante.
Les approches expérimentales conventionnelles pour sonder la nature dynamique de la transduction du signal pendant le développement n'ont pas la résolution spatiale et temporelle souhaitable. Par exemple, les approches pharmacologiques utilisent une petite chemMolécules biologiques ou biologiques pour stimuler ou supprimer la transduction du signal dans les cellules et les tissus. La nature diffusive de ces petites molécules rend difficile de restreindre leur action à une région d'intérêt spécifique 15 . Les approches génétiques ( par exemple, la transgénèse, le système Cre-Lox ou la mutagenèse) conduisent souvent à une activation ou à une répression irréversible de l'expression du gène cible ou de l'activité protéique 16 , 17 , 18 . Le système Tet-On / Tet-Off 19 offre un contrôle temporel amélioré de la transcription des gènes mais manque de contrôle spatial strict car il repose sur la diffusion de la tetracycline. Les développements récents de la dimérisation des protéines chimiquement induites 20 ou des photos 21 , 22 , 23 , 24 ont considérablement amélioréLe contrôle temporel des réseaux de signalisation. Le contrôle spatial, cependant, reste difficile en raison de la nature diffusive des produits chimiques en cage.
Les approches optogénétiques émergentes récentes, qui exploitent la puissance de la lumière pour contrôler les interactions protéine-protéine, permettent la modulation des voies de signalisation avec une haute précision spatio-temporelle ainsi qu'une réversibilité. Peu après son succès initial dans le contrôle des tirs neuronaux 25 , 26 , 27 , l'optogenèse a été étendue pour contrôler d'autres processus cellulaires, tels que la transcription des gènes, la traduction, la migration cellulaire, la différenciation et l'apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Une stratégie utilisant la pLa combinaison de protéines hotoactivables La protéine de cryptochrome 2 d' Arabidopsis thaliana (CRY2) et le domaine N-terminal de l'hélice-boucle de base-hélice basique (CIBN) qui coopère avec le cryptochrome ont récemment été développés pour contrôler l'activité de Raf1 kinase dans des cellules de mammifères et des embryons de Xenopus 35 . CRY2 se lie à CIBN lors de la stimulation de la lumière bleue, et le complexe de protéines CRY2 / CIBN se dissocie spontanément dans l'obscurité 34 . La lumière bleue excite le cofacteur CRY2, le dinucléotide d'adénine de flavine (FAD), ce qui conduit à une modification conformationnelle de CRY2 et à sa liaison ultérieure à CIBN. Des mutants actifs actifs (W374A) et des déficients en flavine (D387A) de CRY2 peuvent être produits par des mutations dans la poche de liaison au FAD: le mutant CRY2 W374A se lie à CIBN indépendamment de la lumière, alors que le mutant CRY2 D387A ne se lie pas à la CIBN sous le bleu - stimulation lumineuse 36 , 37 . Le système opto-génétique décrit iN ce protocole utilise CRY2 et CIBN de type sauvage pour induire une activation de Raf1 médiée par translocation de protéines dans des cellules vivantes. On sait que le recrutement membranaire de Raf1 améliore son activité 38 . Dans ce système, un module tandem CIBN est ancré à la membrane plasma et CRY2-mCherry est fusionné à la N-terminal de Raf1 35 . En l'absence de lumière bleue, CRY2-mCherry-Raf1 reste dans le cytoplasme et Raf1 est inactif. La stimulation à la lumière bleue induit la liaison CRY2-CIBN et recrute Raf1 à la membrane plasmatique, où Raf1 est activé. L'activation de Raf stimule une cascade de signalisation Raf / MEK / ERK. Les protéines de fusion CRY2 et CIBN sont codées dans un système génétique bicistronique. Cette stratégie peut être généralisée pour contrôler d'autres kinases, telles que Akt, dont l'état d'activation peut également être activé par la translocation des protéines dans les cellules 39 . Ce travail présente des protocoles détaillés pour la mise en œuvre de cette stratégie optogénétique dans la culture de cellules de mammifèresRes et des organismes multicellulaires.
La recherche sur les animaux a été menée conformément aux lignes directrices établies par le Comité de l'établissement et de l'alimentation en établissement des animaux de l'Illinois (IACUC) et le Département des ressources animales de l'Université de l'Illinois (DAR).
1. Induction optogénétique de la localisation des protéines dans la culture cellulaire de mammifères BHK21
REMARQUE: Les étapes 1.1-1.3 fournissent une méthode pour assembler une cellule de culture cellulaire pour l'imagerie avec des objectifs de grossissement élevé ( par exemple, 63X ou 100X), qui ont généralement de courtes distances de travail. Ces objectifs nécessitent une fine lamelle de verre ( par exemple, 1,5 pouce d'épaisseur de 170 μm) en tant que substrat d'imagerie. Alternativement, on peut utiliser un plateau / glissière de culture de fond en verre. Dans un tel cas, les étapes 1.1-1.3 peuvent être ignorées.
2. Construction d'une matrice LED pour la stimulation de la lumière à long terme dans un incubateur de CO 2
REMARQUE: Le schéma global de l'installation expérimentale est illustré à la figure 2A .
3. Induction optogénétique de la différenciation cellulaire PC12
4. Contrôle optogénétique de l'activité de la kinase chez les embryons de Xenopus
L'expression ratiométrique des paires de protéines photoactivables: la figure 1A montre la conception d'une construction optogénétique bicistronique, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (appelée CRY2-2A-2CIBN), basée sur le teschovirum porcine- 1 2A (P2A) peptide, qui montre l'efficacité de saut de ribosome le plus élevé parmi les lignées de cellules de mammifères 42 . Dans les travaux antérieurs, il a été déterminé que le ratio optimal pour CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 est 2: 1 35 . Cette configuration permet un recrutement suffisant de membrane et l'activation de CRY2-mCherry-Raf1 ( Figure 1B ). Les cellules transfectées individuellement avec CRY2-2A-2CIBN montrent une fluorescence claire dans les canaux fluorescents GFP et Txred, soit sous epi-illumination ( Figure 1C ), soit en microscopie confocale ( Figure 1D ). Mémoire à médiation légère bleueLe recrutement de CRY2-mCherry-Raf1 ( figure 1D ) peut être clairement détecté en microscopie confocale. L'association se produit en quelques secondes après l'exposition à la lumière bleue ( figure 1E ) et le complexe protéique CRY2-CIBN se dissocie avec une demi-vie d'environ 5,5 min ( figure 1F ).
La différenciation des cellules PC12 contrôlée par la lumière en l'absence de facteur de croissance nerveuse: une observation intrigante dans la signalisation du facteur de croissance est que les voies communes de signalisation en aval ( p. Ex. ERK, PI3K-Akt et PLCγ) suscitent la diversité et la spécificité dans les réponses de signalisation. Une meilleure compréhension de la signalisation par facteur de croissance peut être obtenue en permettant une technologie permettant une régulation spatiotemporelle précise des cascades individuelles. L'approche opto-génétique introduite dans ce protocole démontre une telle technologie qui permet l'activatio spécifiqueN de la voie de signalisation Raf / MEK / ERK avec une résolution temporelle élevée. Parce que cette approche contourne le processus de liaison de NGF à ses récepteurs membranaires, la cinétique de signalisation ne dépend plus des récepteurs endogènes. Au lieu de cela, un contrôle cinétique précis peut être réalisé en modulant le profil temporel de la lumière stimulante ( Figure 2A ). Ainsi, cette approche ouvre de nouvelles possibilités d'étude de la cinétique de signalisation de l'activité kinase. De plus, cette configuration expérimentale offre un moyen extrêmement simple et économique d'intégrer l'approche opto-génétique aux études de transduction du signal intracellulaire ( Figure 2B -2D ). Pour le test de différenciation cellulaire PC12, une stimulation à la lumière continue de 24 h à 0,2 mW / cm 2 est suffisante pour induire une croissance significative des neurites ( Figure 3A ). Contrôles négatifs, y compris les cellules transfectées sans lumière ( Figure 3B) et les cellules non transfectées avec ou sans lumière ( Figure 3C -3D ), ne montrent pas une croissance significative des neurites. À cette puissance, les cellules transfectées avec un Raf1 constitutivement actif (CA-Raf1) subissent une différenciation normale ( Figure 3E ). Notamment, les cellules transfectées avec la construction optogénétique bicistronique produisent un taux de différenciation significativement plus élevé que les cellules co-transfectées avec deux constructions, atteignant la valeur induite par CA-Raf1 ( Figure 3F ). Le rapport de différenciation est calculé en divisant le nombre de cellules différenciées par le nombre de cellules transfectées guidées par fluorescence GFP. Les cellules différenciées sont définies comme celles avec au moins un neurite plus long que la taille du corps cellulaire 35 . Cette amélioration du rapport de différenciation découle de: 1) une meilleure livraison des protéines photoactivables avec le système bicistronique et 2) une opTaux d'expression timatéral entre CIBN et CRY2 35 .
La stimulation optogénétique réversible de la voie de signalisation Raf / MEK / ERK dans les embryons vivants de Xenopus laevis : X. laevis est un organisme modèle bien établi pour l'étude de la transcription des gènes, de la transduction du signal et du développement embryonnaire. Des travaux antérieurs ont révélé que l'activation de la voie Raf / MEK / ERK conduit à un changement de destin de la cellule, ce qui a entraîné la formation d'une structure ectopique en forme de queue au niveau de la nuque 43 . En tant que inducteur de mésoderme puissant, Raf1 surexprimé peut induire le mésoderme ectopique pendant la spécification de la couche germale, qui se produit pendant la blastula et les premiers stades de gastrula, et entraînent la formation de structures ectopiques en queue plus tard. Alternativement, Raf1 surexprimé peut déclencher un événement épithélial-mésenchymateux (EMT) après la spécification de la couche germale a été complété et peut directementTransformez l'ectoderme en lignées neuronales et mésodermiques. Ceci est suivi par la prolifération et l'extension de ces structures 43 . Dans ces expériences, les ARN codant pour le récepteur MET, Ras et Raf1 ont été injectés dans des embryons au stade à deux cellules. Peu de temps après l'injection de l'ARN dans l'embryon, le MET / Ras / Raf1 surexprimé a commencé à activer de façon constitutive les cascades de signalisation en aval. Par conséquent, il était techniquement difficile de contourner les premiers stades de développement et d'activer Raf1 spécifiquement après la spécification de la couche germale. Il était impossible d'utiliser une telle stratégie pour déterminer si l'activation de la signalisation Raf / MEK / ERK après la spécification de la couche germale entraînerait un changement de sort de la cellule, ce qui entraînerait la formation d'une structure ectopique en forme de queue.
L'optogenèse fournit un mécanisme pour contrôler le moment de l'activité Raf1. Lorsque l'ARN de CRY2-2A-2CIBN a été injecté dans des embryons au stade de développement précoceS, Raf1 est resté inactif jusqu'à ce que la lumière bleue soit fournie. Le test du cap animal a été utilisé de manière pratique pour caractériser le résultat de la signalisation, car l'activité ERB basale est faible chez les animaux. L'activation médiée par la lumière de la cascade de signalisation Raf / MEK / ERK a induit une régulation positive significative du xbra, un marqueur mésodermique, déterminé par la RT-PCR ( Figure 4A ) ou l'hybridation in situ intégrée ( figure 4B ). Des changements dynamiques dans la phosphorylation d'ERK en réponse à la lumière bleue ont également été détectés par l'analyse Western-blot ( Figure 4C ). Dans les embryons entiers, un mélange d'ARN CRY2-2A-2CIBN et n-β-gal a été injecté au stade 8 cellules dans l'un des blastomères animaux dorsaux, qui plus tard engendre un tissu antérieur dorsal. Par rapport aux embryons non traités ( Figure 4D -4E ), ceux injectés avec CRY2-2A-2CIBN et traités avec de la lumière bleue pourDes structures ectopiques de queue ( Figure 4F -4G ). Les embryons injectés dans l'obscurité ( Figure 4H ) ou non injectés sous l'éclairage de la lumière bleue ( Figure 4I ) ne formaient pas de structure semblable à la queue. L'illumination à la lumière bleue après la spécification de la couche germale a induit des structures importantes de queue ( Figure 4J ).
Figure 1: Le mécanisme de la localisation des protéines induites par la lumière et l'activation de la voie de signalisation de la kinase. ( A ) Conception d'une construction bicistronique, avec un rapport CIBN-à-CRY2 optimisé (2 CIBN: 1 CRY2) qui permet l'activation induite par la lumière de la voie de signalisation Raf / MEK / ERK kinase. Sur le saut ribosomique, un transcript de l'ARNm génère deux protéines: CRY2-mCherry-Raf1-N2A (finissantAvec NPG d'acides aminés) et proline-2CIBN-GFP-CaaX. ( B ) La liaison induite par la lumière entre CIBN et CRY2 conduit au recrutement par membrane de CRY2-mCherry-Raf1, qui active la voie de signalisation Raf / MEK / ERK. ( C ) Images fluorescentes de cellules BHK21 transfectées avec CRY2-2A-2CIBN sous epi-illumination. Barre d'échelle: 20 μm. ( D ) Imagerie par fluorescence confocale de cellules transfectées avec CRY2-2A-2CIBN. Le panneau de gauche montre 2CIBN-GFP-CaaX clivé localisé sur la membrane plasmatique; Le panneau central montre un instantané de CRY2-mCherry-Raf1 avant la stimulation de la lumière bleue; Le panneau de droite montre un instantané de CRY2-mCherry-Raf1 après 10 impulsions de stimulation de lumière bleue. Le panneau inférieur affiche des profils d'intensité normalisés le long d'une ligne pointillée jaune à travers la cellule, avant et après la stimulation de la lumière. Barre d'échelle = 20 μm. ( E - F ) Cinétique pour association CRY2-CIBN induite par la lumière ( E ) et dissociation spontanéeN ( F ) du complexe de protéines CRY2-CIBN dans l'obscurité. La figure 1A- B a été adaptée à partir de la référence 35 , reproduite avec l'autorisation de la Société des biologistes. La figure 1E -F a été adaptée à partir de la référence 44 sous la licence Creative Commons Attribution (CC BY). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Conception et étalonnage de la matrice LED à la maison. ( A ) Schéma de la configuration expérimentale pour l'activité kinase contrôlée par la lumière dans les cellules vivantes. ( B ) Planche de circuit pour le tableau à LED construit à la maison. ( C ) A ligHt box qui peut être utilisé pour la stimulation de la lumière à long terme dans un incubateur de CO 2 . La hauteur de la boîte en aluminium est de 2 po ( D ) Puissance de sortie LED typique en fonction de la tension. Valeur de la puissance de la lumière par LED dans un circuit dans lequel une résistance de limitation de courant et quatre LED sont connectées en série. La figure 2A a été adaptée à partir de la référence 35 , reproduite avec l'autorisation de la Société des biologistes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Induction optogénétique de la différenciation cellulaire PC12. ( A ) Instantanés multicanaux de cellules PC12 transfectées avec CRY2-2A-2CIBN après 24 h de stimulation par lumière bleue (0,2 mW / cm 2 ). A cIrcle marque une cellule différenciée. Un carré marque une cellule indifférenciée. ( B ) Identique à ( A ), sauf qu'aucune stimulation à la lumière bleue n'a été utilisée. ( C - D ) Cellules PC12 non transfectées sous 24 h de stimulation de lumière bleue (0,2 mW / cm 2 ) ( C ) ou incubation sombre ( D ). ( E ) Images représentatives de cellules transfectées avec Raf1-GFP-CaaX (CA-Raf1). Le cercle et le rectangle marquent des cellules différenciées et indifférenciées, respectivement. ( F ) Ratios de différenciation des cellules PC12 transfectées avec CA-Raf1, co-transfectées avec CRY2-mCherry-Raf1 et CIBN-GFP-CaaX, et transfectées individuellement avec CRY2-2A-2CIBN. 24 h après la transfection, les cellules ont été exposées à la lumière ou incubées dans l'obscurité pendant encore 24 h. Les valeurs représentent la moyenne ± SD à partir de quatre ensembles de données indépendants. Seules les cellules exposées à la lumière bleue ont montré une différenciation significative. Figure 3FA été adapté à partir de la référence 35 , reproduit avec l'autorisation de la Société des Biologistes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Induction optogénétique de l'activité kinase chez les embryons Xenopus vivants. ( A ) Les résultats de la RT-PCR montrant que l'exposition à la lumière bleue a induit l'expression de xbra, un marqueur pan-mésodermique, dans des capuchons d'animaux injectés par CRY2-2A-2CIBN au début de la phase de gastrula. ( B ) hybridation in situ intégrée du xbra dans les embryons. L'activation induite par la lumière de l'activité MAPK module la répartition spatiale du xbra (flèches rouges dans le panneau inférieur droit). Les flèches noires marquent le nucléaire β-gaLactosidase comme traceur de lignée. AP: pote animal. VP: pôle végétal. ( C ) Analyse Western-Blot montrant que, dans un test de capuchon animal, CRY2-2A-2CIBN a induit une phosphorylation réversible dépendant de la lumière bleue de ERK. ( D ) Images montrant la morphologie des embryons normaux, sans injection d'ARNm et sans traitements légers. ( E ) Une image agrandie d'un seul embryon. ( F - G ) Images agrégées et entières pour les embryons injectés avec ARNm CRY2-2A-2CIBN et soumises à une stimulation par lumière bleue. L'activation de Raf1 en traitant les embryons injectés par CRY2-2A-2CIBN avec de la lumière bleue induit des structures ectopiques en forme de queue dans la région de la tête. ( H - I ) Contrôles négatifs, y compris les embryons injectés avec CRY2-2A-2CIBN mais sous incubation sombre ( H ) et embryons non injectés sous stimulation par la lumière ( I ). Toutes les expériences de stimulation de lumière ont été réalisées avec une puissance de 5 mW / cm 2. ( J ) Analyse statistique du pourcentage d'embryons présentant une structure ectopique en forme de queue sous chaque condition. Barre d'échelle = ( D ) et ( G ): 1 mm; ( E - F ) et ( H - I ) 0,5 mm. Les figures 4A , C , E - F et H - J ont été adaptées à partir de la référence 35 , reproduites avec la permission de la Société des biologistes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Lors de la construction de la boîte à lumière, la puissance des LED individuelles doit être mesurée. Sur la base de l'expérience précédente, la puissance de sortie peut varier entre les LED individuelles en raison de la variance de fabrication. Sélectionnez un ensemble de LEDs ayant une puissance inférieure à 10% l'une de l'autre. Le nombre de diodes électroluminescentes, la résistance de limitation de courant et l'entrée de puissance peuvent être modifiés pour différents types de conteneurs de culture cellulaire ( par exemple, une plaque de 6 puits ou de 24 puits). Un effet de lumière de 24 h à une puissance de 0,2 mW / cm 2 n'induit pas une phototoxicité détectable 44 . Si une puissance plus élevée est utilisée, envisagez d'utiliser une lumière intermittente pour réduire la production de chaleur et la phototoxicité. Le système opto-génétique introduit dans ce protocole induit une croissance des neurites dans les cellules PC12 sous stimulation intermittente de la lumière comparable à celle de la stimulation continue de la lumière, étant donné que l'intervalle sombre entre les deux impulsions lumineuses adjacentes est inférieur à 45 min 44 . DûAux différences intrinsèques dans la cinétique de l'association et de la dissociation des protéines, la durée entre les impulsions lumineuses doit être accordée pour chaque paire de protéines unique. La surexpression du cytosolique Raf1 ne provoque pas de différenciation cellulaire PC12 sans éclairage bleu. En contrôlant la quantité d'ARNm injectée dans chaque embryon, aucun phénotype embryonnaire important n'a été observé dans l'obscurité.
Bien qu'une lumière bleue de faible puissance soit suffisante pour stimuler l'association des protéines de fusion CRY2 et CIBN, la faible profondeur de pénétration de la lumière bleue limite son utilisation dans la stimulation des tissus profonds. Bien qu'une telle stimulation ait été obtenue en fournissant de la lumière par d'autres dispositifs ( p. Ex. Fibre optique), les approches sont invasives 45 . Ce problème peut être abordé de deux façons: en utilisant une paire de protéines qui répond à une longueur d'onde plus longue ( par exemple, la paire de protéines phytochrome-PIF6) ou en utilisant une excitation à deux photons. Les deux approches peuvent fournir deepeR pénétration, mais ils pourraient souffrir d'autres limitations. Par exemple, la paire PhyB-PIF6 nécessite un cofacteur synthétique, et la microscopie à deux photons nécessite une instrumentation coûteuse. Le manque d'accordabilité dans l'interaction CRY2-CIBN est une autre limitation à considérer. Le CRY2 de type sauvage se dissocie spontanément de CIBN avec une demi-vie de 5,5 min dans l'obscurité 34 . Selon la cinétique de la voie de signalisation cible, une demi-vie de dissociation raccourcie ou prolongée peut être préférée. Des mutations dans CRY2 ont été faites qui peuvent raccourcir la demi-vie de dissociation à 2,5 min (W349R) ou la prolonger à 24 min (L348F) 46 . Alternativement, les paires de protéines photovoltaïques conçues à base de récepteurs fongiques Vivid (VVD) et p / nMagFast1 et 2 montrent une demi-vie de dissociation de 4,2 min et 25 s, respectivement 47 . Dans ce protocole, la paire de protéines CRY2-CIBN de type sauvage active la voie MAPK dans les 5 min de lumièreEt l'activité se désintègre au niveau basal dans les 30 min dans les cellules de mammifères 44 et 1-2 h dans les embryons de Xenopus 35 . Pour le contrôle spatial, la microscopie confocale peut focaliser le laser bleu sur la taille d'un point de limite de diffraction d'environ 200 nm dans le plan de l'image. En ajustant la taille du diagramme de champ dans un microscope à épi-éclairage équipé d'une source lumineuse non cohérente, il est possible de limiter la taille de l'éclairage à environ 10 μm de diamètre. Les deux méthodes devraient être capables d'atteindre le contrôle subcellulaire de la stimulation optogénétique dans les cultures cellulaires.
La capacité de l'optogenèse à interroger de manière réversible la transduction du signal avec une résolution spatiale et temporelle élevée offre une opportunité entièrement nouvelle d'étudier la signalisation intracellulaire dynamique dans les cellules vivantes. Les résultats de ce protocole ont révélé que l'activation de Raf1 est principalement responsable de l'induction de la différenciation neuronale chez le PC12 cellules 44 . La même voie entraîne également la formation de structures secondaires de queue dans le développement d'embryons de Xenopus . En contrôlant le moment de l'activation de Raf1, la structure en forme de queue peut être induite après le stade de formation de la couche germinale 35 . La méthode LOVTRAP récemment décrite utilise deux protéines modifiées, Zdark et LOV2, qui se lient sélectivement l'une à l'autre seulement dans l'obscurité pour moduler la dissociation induite par la lumière d'une protéine d'intérêt (POI) 48 . Contrairement à l'association protéine-protéine médiée par la lumière, qui est utilisée dans cette approche, LOVTRAP utilise la lumière pour induire la dissociation des protéines. Cette nouvelle modalité est plus souple pour moduler la localisation et l'activité des protéines dans les cellules vivantes. En sélectionnant soigneusement le mode d'activation dans une cascade de signalisation, il est possible de disséquer la transduction du signal de manière non conventionnelle. Par exemple, il est possible d'activer les récepteurs tyrosine kinases sans lIgG-récepteur 49 ou pour induire un sous-ensemble de cascades de signalisation provoquées par un ligand 44 . La stratégie rapportée ici peut être généralisée pour contrôler d'autres kinases, telles que Akt 39 et GTPases ( p. Ex. Rho GTPase), dont les états d'activation peuvent également être activés par translocation de protéines. L'optogenèse continuera d'être appliquée aux organismes multicellulaires en direct, comme en témoignent les travaux récents portant sur le contrôle optogénétique de la localisation et de la signalisation des protéines dans les embryons de Drosophila 50 , 51 , 52 , 53 , 54 et Xenopus 35 .
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Ce travail a été soutenu par l'Université de l'Illinois à Urbana-Champaign (UIUC) et les National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
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