Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d'adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d'une manière non-invasive par l'impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation adhérence dépendant.

L'adhérence cellule-matrice jouent un rôle clé dans le contrôle de la morphologie cellulaire et de signalisation. Les stimuli qui perturbent l'adhérence cellule-matrice (par exemple, la myéloperoxydase et d'autres oxydants de matrice modificateur / enzymes libérées au cours de l'inflammation) sont impliqués dans le déclenchement des changements pathologiques dans la fonction cellulaire, le phénotype et la viabilité dans un certain nombre de maladies. Ici, nous décrivons comment impédance cellule-substrat et les approches d'imagerie des cellules peuvent être facilement utilisés pour quantifier avec précision les changements en temps réel dans l'adhésion cellulaire et de-adhérence induite par modification de la matrice (en utilisant des cellules endothéliales et myéloperoxydase comme un stimulus de matrice modifier physiopathologique) avec une résolution temporelle élevée et d'une manière non-invasive. Le système de l'impédance cellule-substrat xCELLigence quantifie en continu la zone d'adhérence cellule-matrice, en mesurant l'impédance électrique à l'interface cellule-substrat dans les cellules cultivées sur des réseaux de microélectrodes or. L'analyse des images du time-lapse différenLes films tiel de contraste d'interférence de quantifier l'évolution de la surface projetée de cellules individuelles dans le temps, représentant les changements dans la zone de contact cellule-matrice. Les deux techniques de quantifier avec précision les changements rapides aux processus d'adhésion cellulaire et de-adhérence. Impédance Cell-substrat sur les tableaux de microélectrodes biocapteurs fournit une plate-forme pour des mesures robustes, à haut débit. Analyse imagerie des cellules vivantes fournir des détails supplémentaires concernant la nature et la dynamique des changements morphologiques quantifiés par des mesures d'impédance cellule-substrat. Ces approches complémentaires fournissent de précieuses informations sur la façon dont la modification oxydative myéloperoxydase catalysée subcellulaires composants de la matrice extracellulaire déclenche des changements rapides dans l'adhésion cellulaire, la morphologie et de signalisation dans les cellules endothéliales. Ces approches sont également applicables pour l'étude de la dynamique d'adhésion cellulaire en réponse à des stimuli autres modificateurs de matrice et des cellules adhérentes connexes (par exemple, des cellules épithéliales).

Adhésives contacts stables entre les cellules et leur matrice extracellulaire environnante sont nécessaires pour le maintien de l'homéostasie tissulaire. Par exemple, l'adhésion des cellules endothéliales à la matrice sous-endothéliale dans les vaisseaux sanguins joue un rôle critique dans le maintien de l'intégrité de la couche endothéliale et sa fonction de régulation homéostatique comme une barrière semi-perméable vasculaire ^1. Le cytosquelette d'actine est mécaniquement couplé à l'adhésif molécules de la matrice sur les sites d'adhérence cellule-matrice et des contacts d'adhésif à l'interface cellule-matrice jouent un rôle important dans la détermination de la position de la membrane cellulaire en résistant à des forces de traction actomyosine centralement dirigées. Stimuli extracellulaires qui modifient cellule-matrice adhérence modifierait nécessairement l'équilibre des forces à l'interface cellule-matrice, un événement qui est rapidement "senti" par des protéines de signalisation mécano-sensibles, résultant dans la transduction du "outside-in de signalisation". Ce pari diaphonieWeen cellules et leur matrice extracellulaire environnante joue un rôle clé dans le contrôle de la forme des cellules, la motilité, la fonction, la prolifération et la survie ^2.

Les processus physiopathologiques variés (le développement embryonnaire, l'inflammation, la cicatrisation des plaies et les métastases du cancer) sont caractérisées par le remodelage dynamique de substrats de la matrice d'adhésif par des oxydants et / ou des enzymes dégradant la matrice ^3,4. Par exemple, l'adhésif protéines de la matrice sous-endothéliale des vaisseaux sanguins (par exemple, la fibronectine) sont impliqués que les principaux objectifs de la modification ou de la dégradation dans les maladies inflammatoires humaines en raison de la production localisée d'oxydants réactifs (par exemple, l'acide hypochloreux, HOCl) par l'enzyme de leucocytes dérivés myéloperoxydase (MPO), qui se accumule dans le sous-endothelium vasculaire au cours de la maladie inflammatoire (figure 1) ^9/5. Changements dans la cellule-matrice adhérence induites par MPO-oxydants dérivés et autres stimuli de matrice modifier sont likely à jouer un rôle important dans la modification de l'homéostasie vasculaire au cours de divers processus pathologiques, par exemple, par modification de la signalisation des cellules endotheliales, la morphologie et la viabilité, ce qui perturbe la fonction endothéliale et l'intégrité de la barrière. Toutefois, les réponses de signalisation morphologiques et cellulaires de cellules adhérentes à des modifications de la matrice extracellulaire commencent seulement à être compris.

Pour comprendre comment les modifications de la matrice dictent l'évolution de la dynamique d'adhésion cellulaire et voies de signalisation cellulaire d'adhésion dépendant, les techniques sont tenus que de quantifier avec précision les changements dans la cellule-matrice adhérence en temps réel, avec une haute résolution temporelle. Ici, nous décrivons complémentaire impédance cellule-substrat et des techniques d'imagerie des cellules vivantes qui répondent à ces critères et qui fournissent une plate-forme pour quantifier l'adhésion cellulaire et des processus de-adhérence d'une manière non-invasive.

Nous montrons comment ces cellules impédance-substrat et imagerie des cellules vivantes Approdouleurs peuvent être facilement utilisés pour (i) suivre la dynamique de l'attachement des cellules et la diffusion (ce est à dire, de novo adhésion cellulaire) sur des substrats de matrice natifs et modifiés, et (ii) pour mesurer la dynamique de détachement cellulaire matrice (c.-de-adhérence ) par des cellules adhérentes exposés à des stimuli de matrice modificateurs. Le système xCELLigence cellule-substrat impédance biocapteur fournit une mesure en continu de la zone de contact cellule-matrice par la quantification de l'impédance électrique à la surface de 96 puits réseaux de microélectrodes de l'or et exprime ces mesures d'impédance électrique comme "indice de cellule", une valeur sans dimension qui est en grande partie proportionnelle à la surface de contact de substrat de cellule ¹⁰ (figure 2), tout en étant également sensibles aux variations de la distance moyenne entre le (isolante) membrane cellulaire et la surface d'électrode ^11. Une augmentation supplémentaire de valeurs de l'indice de la cellule est également atteint lors de la formation du serrée contacts cellule-cellule that restreindre courant paracellulaires, ¹¹ des conditions qui ne existent pas dans les expériences décrites dans cette étude. Mesure de la surface projetée des cellules individuelles au fil du temps par analyse d'image de time-lapse contraste d'interférence différentiel (DIC) des films fournit une mesure complémentaire de changements dans le domaine de contact cellule-substrat et fournit des informations supplémentaires concernant la nature exacte et la dynamique de la changements morphologiques quantifiés par la méthode de l'impédance cellule-substrat.

Plus précisément, nous décrivons l'application de ces approches pour contrôler la manière dont l'oxydation des adhésifs protéines de la matrice sous-endothéliale (par exemple, la fibronectine) (i) MPO-médiée réduit l'adhérence de novo de cellules endothéliales en suspension sur de la fibronectine purifiée et (ii) déclenche cellule-matrice de -adhesion dans les cellules endothéliales avec adhérence établie sur la fibronectine. En effectuant la signalisation cellulaire parallèle des analyses au fil du temps en utilisant Biochem pertinentesdosages iCal (par exemple, Western blot), les relations temporelles et causales entre les processus adhérence / de-adhésion et les changements associés à la signalisation cellulaires événements d'adhésion dépendant peuvent être déterminées.

Ces approches ont été récemment utilisés pour démontrer que l'oxydation de la matrice extracellulaire catalysée par les dépôts sous-endothéliaux de MPO déclenche une perte rapide de la cellule-matrice adhésion des cellules endothéliales qui est entraîné par des forces contractiles actomyosine préexistants ^9. Fait important, en permettant à la relation temporelle entre les changements à la fois dans l'adhérence cellulaire et de signalisation à déterminer l'adhésion cellulaire dépendante, ces approches ont identifié que la modification de la matrice MPO induite et cellulaire de-adhérence déclenche changements de signalisation cellulaires voies importantes d'adhérence dépendant notamment Src kinase dépendante de la phosphorylation paxilline et chaîne légère de myosine II phosphorylation (Figure 1) ^9. Ce mode de signalisation redox dépendantes, invÉSOLUTION l'activation des événements de signalisation intracellulaire par des réactions d'oxydation extracellulaires qui perturbent l'adhérence cellule-matrice, représente un nouveau mode de signalisation cellulaire appelée "outside-in signalisation redox" (figure 1) ^9.

En général, ceux-ci complémentaire biocapteur de l'impédance cellule-substrat et des approches d'imagerie des cellules devraient être utiles pour révéler comment différents stimuli ou des agents matriciels modificateurs de route changements dans la dynamique de l'adhérence cellulaire, la morphologie et de signalisation au sein de différents types de cellules adhérentes soumises à une grande variété de paramètres expérimentaux.

Le protocole suivant décrit comment quantifier l'impact de l'oxydation de la matrice MPO médiation de novo sur l'adhérence des cellules endothéliales (Experiment 1) et la cellule de-adhésion endothéliale (Experiment 2) des processus. MPO se lie avec avidité à la fibronectine et d'autres protéines de la matrice extracellulaire sous-endothéliaux et nous adhésiveses peroxyde d'hydrogène (H ₂ O ₂₎ pour convertir les ions chlorure (Cl ^-) à la très réactif chloration oxydante de l'acide hypochloreux (HOCl), qui réagit à proximité de ces protéines de la matrice et perturbe les propriétés adhésives de la cellule (Figure 1) ^{8,9, 12.}

1. Généralités cellules endothéliales Culture

1. Culture des cellules bovines endotheliales aortiques (passages 4-9) sur des flacons de culture tissulaire revêtues de gélatine (couche de surface de culture de tissu avec 0,1% p / v de gélatine dans du PBS à température ambiante pendant 15 min) dans EGM-2 médias (à l'EGM-2 balle Kit contenant 5% de sérum bovin foetal, des facteurs de croissance et tous les suppléments fournies par le fabricant, à l'exception de l'hydrocortisone).
2. Lorsque les cellules sont confluentes à court (environ 3 jours après le semis, après une 1: split 4), la récolte des cellules par traitement avec 0,05% p / v de trypsine / 0,02% p / v d'EDTA dans du PBS à 37 ° C. Après la majorité des cellules ont détaché, ajouter complets EGM-2 médias pour étancher la trypsine puis centrifugeuse (100 xg, 5 min).
3. Préparation des cellules pour des études sur l'adhérence de novo de cellules endotheliales vers la fibronectine (Expérience 1: Section 2) et le de-adhérence ultérieure des cellules endothéliales avec une adhérence établie sur ce substrat (expérience 2: Section 3).
   1. Laver récoltésles cellules une fois avec du exempt de sérum de Milieu 199 contenant 1% p / v d'albumine de sérum bovin (BSA) et re-centrifugation (100 x g, 5 min).
   2. Re-suspendre les cellules dans un milieu sans sérum 199 contenant 1% p / v de BSA à 2,5 x 10 ⁵ cellules / ml (mesures d'impédance cellule-substrat) ou 5 x 10 ⁵ cellules / ml (analyses imagerie des cellules vivantes) et maintenir à 37 ° C avant utilisation.
      NOTE: Les réponses d'adhérence de cellules sont très sensibles aux différences de température (par exemple, en raison des effets de convection) si tous les équipements et solutions utilisés pour manipuler et traiter les cellules pendant les protocoles suivants doivent être maintenus à une température constante de 37 ° C.

2. Expérience 1: Quantification De Novo Endothelial Cell Adhesion sur la fibronectine autochtones et MPO-oxydé (Cell-substrat Impédance)

REMARQUE: Expérience 1 examine la mesure dans laquelle MPO médiation oxydation de fibronectine compromet sa capacité à soutenir de novo Adhésion des cellules endothéliales en suspension.

1. Manteau fibronectine sur 96 puits or cellule-substrat tableaux impédance de microélectrodes. Ajouter 80 pl / puits de bovin purifié fibronectine à 5 ug / ml dans PBS, incuber pendant deux heures à 37 ° C et retirer la solution.
2. Incuber les surfaces revêtues de fibronectine avec MPO pour permettre la liaison de la MPO lié à la surface de la fibronectine. Ajouter 80 ul / puits de MPO purifié neutrophile humaine à 20 nm dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C.
3. Laver les surfaces deux fois avec HBSS pour éliminer toute MPO non lié.
4. Ajouter H ₂ O ₂ (0 à 10 uM de concentration finale) dans des puits de la plaque de matrice de microélectrodes contenant 80 pl / puits de HBSS pour initier catalysée par la MPO, l'oxydation de la fibronectine HOCl-dépendante et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C.
5. Pour examiner l'effet des inhibiteurs ou modulateurs de réactions catalysées MPO pertinents (par exemple, alternative enzyme MPOles substrats, les inhibiteurs de l'enzyme ou des antioxydants; voir ⁹ pour plus de détails), les ajouter à la HBSS immédiatement avant H ₂ O ₂ plus.
6. Après 0,5 h, traiter les surfaces avec de la méthionine pour étancher espèces oxydantes de surface liée résiduels, ce est-chloramines liés aux protéines réactives, qui peuvent exercer des activités cellulaires de confusion. Ajouter 10 mM méthionine dans 80 ul HBSS par puits et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
7. Bloquer surfaces avec de la BSA. Ajouter 80 pl / puits de BSA à 0,2% p / v dans PBS, incuber pendant deux heures à 37 ° C et retirer la solution.
   REMARQUE: des régions de surface non revêtues résiduels appuieront l'adhésion cellulaire et en bloquant ceux-ci avec une protéine non-adhésif (par exemple, BSA) veille à ce que les réponses d'adhérence cellulaire dépendent étroitement de la matrice de cellules-adhésif purifié utilisé, dans ce cas, la fibronectine.
8. Laver les surfaces deux fois avec HBSS.
   REMARQUE: Aucun des traitements de surface précédentes affecte sensiblement cellule-substrat readings.
9. cellules endothéliales suspension de semences (ajouter 200 pl / puits à environ 2,5 x 10 ⁵ cellules / ml, préparés dans un milieu sans sérum contenant 199 BSA 1%, voir 1.3) sur les surfaces revêtues de fibronectine indigènes ou MPO-oxydés.
10. Immédiatement après l'ensemencement des cellules (à savoir, avant tout attachement des cellules et la diffusion), monter la plaque de réseau de microélectrodes sur l'orifice d'incubateur (logée dans un incubateur à 37 ° C en présence de 5% CO _2).
    1. Utilisation du logiciel de l'instrument immédiatement prendre un «blanc» pour normaliser la lecture ultérieure impédance cellule-substrat («indice de la cellule») des valeurs aux valeurs de fond initiales obtenues en l'absence d'adhésion cellulaire.
    2. Initier acquisition de données d'index cellulaire continue (minimum d'une cellule indice lecture / min).
11. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 2 heures, période de temps pendant laquelle l'attachement des cellules et la diffusion maximale est obtenue; ce qui se traduit parun plafonnement des valeurs d'index de cellule (voir la figure 3A).
    NOTE: L'expérience précédente (Expérience 1) examine la façon initiale MPO oxydation médiée par la fibronectine limite la capacité des cellules endotheliales à établir l'adhérence des cellules sur ce substrat. L'expérience (Experiment 2) suivante examine comment l'oxydation de la fibronectine MPO médiation favorise diminutions dans la cellule-matrice adhérence (ce est à dire, de-adhérence) dans les cellules endothéliales avec adhérence établie sur ce substrat. Les traitements de ces deux expériences sont essentiellement identiques, sauf pour le temps d'oxydation à médiation par MPO fibronectine (à savoir, avant l'adhésion cellulaire - Expérience 1, après l'adhésion cellulaire - Expérience 2).

3. Expérience 2: Quantification des cellules endothéliales De-adhérence de fibronectine en réponse à MPO médiation fibronectine oxydation (Impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes)

1. Manteau fibronectine sur 96 puits microélectrodes d'or unerrays pour des mesures d'impédance cellule-substrat (ajouter 80 ul / puits de la fibronectine à 5 ug / ml dans du PBS et on incube pendant 2 heures à 37 ° C) ou des plaques de culture cellulaire à fond de verre de 35 mm pour les analyses d'imagerie des cellules (ajouter 2 ml / boîte de fibronectine à 5 ug / ml dans du PBS et on incube pendant 2 heures à 37 ° C).
2. Bloquer surfaces avec de la BSA. Ajouter BSA à 0,2% p / v dans du PBS à des volumes indiqués dans 3,1 et incuber pendant 2 heures à 37 ° C.
3. Incuber surfaces avec MPO pour permettre la liaison du MPO à la fibronectine. Ajouter 20 nM MPO humaine purifiée dans du HBSS les volumes indiqués dans 3,1 et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C.
4. Laver les surfaces deux fois avec HBSS pour éliminer toute MPO non lié.
5. cellules endothéliales de semences en suspension (préparés Milieu 199 contenant 1% p / v de BSA sans sérum; voir 1.3) sur les surfaces revêtues de fibronectine indigènes ou MPO-portant.
   1. Ajouter 200 ul / puits à 2,5 x 10 ⁵ cellules / ml à 96 puits cellule-substrat tableaux impédance de microélectrodes.
   2. Ajouter 2 ml / boîte à 5 x 10 ⁵ cellules / ml à 35 mm à fond de verre plats de culture cellulaire.
6. Immédiatement après l'ensemencement des cellules (ce est à dire, avant toute fixation des cellules et la diffusion):
   1. Mont 96 des plaques de matrice de microélectrodes sur le Port impédance incubateur cellulaire substrat (logé dans un incubateur à 37 ° en présence de 5% de CO ₂₎ et prendre des lectures «en blanc» pour lancer l'acquisition continue de données d'index cellulaire (cf. Section 2.10 ).
   2. Transfert à fond de verre 35 mm boîtes de culture cellulaire à un incubateur à 37 ° C en présence de 5% CO _2.
7. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 heures pour permettre la fixation des cellules et maximale d'écartement (voir section 2.11).
8. Retirez brièvement les (lectures d'index de la cellule de pause à ce stade) de 96 puits de plaque de matrice de microélectrodes ou 35 mm à fond de verre cellulaire boîte de culture de la 37 ° C incubateur, retirez surnageant cellulaire et ajouter réchauffé (37 ° C) HBSS (volumes que per étape 3.1).
   REMARQUE: HBSS est employée lorsque l'on étudie MPO-réactions d'oxydation catalysée place de milieux de culture complète que celle-ci contient des espèces oxydables qui interfèrent avec les réactions d'oxydation.
9. Pour examiner l'effet des inhibiteurs / modulateurs des réactions catalysées par la MPO (substitution des substrats enzymatiques, des inhibiteurs enzymatiques ou des antioxydants ou des inhibiteurs) de signalisation cellulaire (par exemple, 40 uM blebbistatin pour inhiber la contractilité actomyosine), ajouter ces maintenant.
10. Placer immédiatement la plaque de matrice de microélectrodes de nouveau dans les (lectures d'index cellulaire re-commence à ce point) 37 ° port incubateur C ou le verre de 35 mm à fond plat de culture cellulaire de retour dans le 37 ° C incubateur, et permettent aux cellules de se équilibrer dans le HBSS pendant 0,5 heure.
    NOTE: Après 0,5 h équilibrage dans HBSS, les valeurs de l'indice de la cellule se stabilisent à des valeurs légèrement inférieures; lorsque les cellules pré-incubation avec des substrats d'enzyme, l'enzyme et les inhibiteurs de la signalisation des cellules ou des antioxydants, assurer d'abord que tHese ne affecte pas significativement les valeurs obtenues après équilibrage.
11. Initier MPO-catalysée, l'oxydation de la fibronectine HOCl-dépendante et dé-adhérence.
    1. Pour les études d'impédance de cellules en utilisant 96 des plaques de matrice de microélectrodes:
       1. Retirer la plaque de matrice de microélectrodes de l'incubateur et de pause des mesures d'indice de la cellule.
       2. Ajouter H ₂ O ₂ (concentration finale de 0 à 10 uM) à la HBSS et mélanger doucement par pipetage répété.
       3. Immédiatement, re-fixer le réseau de microélectrodes de retour sur l'orifice d'incubateur à 37 ° C et à nouveau commencer l'acquisition de valeurs d'index de cellule.
    2. Pour les études d'imagerie des cellules vivantes en utilisant 35 mm boîte de culture de cellules de verre à fond:
       1. Retirer la boîte de culture de l'incubateur et monter sur une scène 37 ° C chauffée d'un microscope confocal inversé équipé d'un objectif 63X d'eau avec optique DIC appropriés pour l'enregistrement de films de cellules vivantes.
       2. Focus sur les cellules etoptimiser l'optique DIC (éclairage de Köhler, biais retard et décalage caméra / de gain; pour plus de détails, voir ^13).
       3. Initier film DIC et enregistrer des lectures de base de cellules non traitées pendant 1 min.
       4. Ajouter H ₂ O ₂ (concentration finale de 0-10 uM) et mélanger délicatement par pipetage répété. Re-concentrer le microscope (si nécessaire) et continuer l'enregistrement de films DIC des cellules traitées pour la période de temps requise.

4. Analyse et présentation des données

1. Données d'impédance cellule-substrat
   1. Exporter des données brutes (indice de la cellule en fonction du temps) dans un tableur.
   2. Pour les études cellule de-adhérence (Expérience 2: Section 3), normaliser les données en définissant des valeurs enregistrées immédiatement avant le début de l'oxydation de la fibronectine MPO-médiation à une valeur de 1 (ce est à dire, immédiatement avant l'ajout de H ₂ O ₂ en 3.11 .1.1).
      NOTE: Cela garantit que, par rapportchangements dans les valeurs de l'indice de cellules induites par l'oxydation de la fibronectine MPO médiation ne sont pas masqués par de petites différences initiales dans les valeurs de l'indice de cellule absolue entre les puits.
      1. Les données actuelles que des parcelles de l'indice normalisé de cellules (axe des y) en fonction du temps (axe des x).
2. Données d'imagerie de cellules vivantes (études cellule de-adhésion dans l'expérience 2: article 3)
   1. Ouvrez DIC vivent les films d'imagerie cellulaire enregistrées immédiatement avant et après l'ouverture de l'oxydation de la fibronectine MPO médiation dans un programme d'analyse d'image standard (par exemple, logiciel ImageJ).
   2. Dans au moins deux films distincts DIC sélectionner au hasard plusieurs cellules et mesurer leur surface projetée en images séquentielles (par exemple, à des intervalles de 1 min) en traçant manuellement leur bord de la membrane et de quantifier le nombre de pixels fermés.
   3. Exportation des données brutes (surface cellulaire projetée en fonction du temps) à une feuille de calcul Excel et normaliser les données de la zone cellulaire en fixant des valeurs enregistrées immédiatement avantl'initiation de l'oxydation de la fibronectine à médiation MPO à une valeur de 1 (ce est à dire, immédiatement avant l'addition de H ₂ O ₂ dans 3.11.2.3).
   4. Les données actuelles comme une parcelle de la zone normalisée cellulaire (axe des y) en fonction du temps (axe des x).

Quantification en temps réel des cellules endotheliales de-adhérence de fibronectine, en réponse à l'oxydation de la fibronectine MPO médiée (Expérience 2). L'ensemencement des suspensions de cellules endotheliales sur native (MPO libre) fibronectine ou MPO portant les résultats de la fibronectine dans l'attachement cellulaire maximale et d'étalement moins de 2 heures, tel que jugé par un plafonnement des valeurs d'index de cellule de la mesure de l'impédance du substrat cellulaire (figure 3A). Cette phase initiale de la fixation des cellules et la diffusion est nettement réduite lorsque l'oxydation de la fibronectine à médiation MPO est initiée avant l'ensemencement des cellules dans des expériences réalisées selon le protocole décrit dans l'expérience 1 (données non présentées; Pour plus de détails, voir ^9). Une fois l'adhésion cellulaire maximale est établie sur la fibronectine native ou MPO-palier, l'oxydation de la fibronectine à médiation par HOCl catalysée par la MPO cible (initiée par l'ajout de co-substrat de la MPO H ₂ O ₂₎ provoque une diminution rapide de la surzone du visage du contact cellule-matrice mesuré par impédance cellule-substrat (figure 3A, B) et par imagerie de cellules vivantes (figure 3C; un représentant film DIC, voir Film 1; indice de cellule ou zone de cellule pertes après H ₂ O ₂ plus sont minimes en l'absence de MPO ^9). Alors que l'indice de la cellule et de la zone cellulaire changements au cours de MPO-induite de-adhérence étaient très similaires, les baisses relativement plus lents dans les valeurs de l'indice de la cellule peuvent refléter les effets isolants de matériaux présents dans les régions «libre-cellulaires" membrane cellulaire à la périphérie de la cellule lors de dé- adhérence, qui ne sont pas quantifiée dans les mesures de surface cellulaire projetés. L'adhérence cellulaire de-rapide apparent dans les cellules endothéliales liées à la fibronectine MPO-palier en réponse à H ₂ O ₂ est absent traitement dans les cellules traitées avec H ₂ O ₂ seul (ce est à dire, les cellules qui ne contiennent pas la MPO) (figure 3A) et b est bloquéinhibiteurs de l'enzyme y MPO ou charognards HOCl (données non représentées, voir ⁹ pour plus de détails), l'identification que ce processus est tributaire de la production MPO-catalysée de HOCl (cf. Figure 1). L'inhibition de la myosine II fonction motrice avec blebbistatin inhibe le taux de cellules endothéliales de-adhésion mesurée par la cellule-substrat impédance (figure 3B) et par imagerie de cellules vivantes (figure 3C, Movie 2), d'identification qui cellulaire de-adhérence et la contraction en réponse à l'oxydation de la matrice subcellulaire MPO catalysée est entraîné par les forces de traction actomyosine ^neuf.

Oxydation de la matrice subcellulaire Figure 1. MPO à médiation cellulaire déclenche matrice de coefficient d'adhérence et la signalisation cellulaire. MPO déclenche des réponses rapides de-adhérence et des changements dans la signalisation de l'adhérence par médiation dépend o cibléexidation des adhésifs sous-endothéliales protéines de la matrice, impliquant les événements ⁹ ci-après: (A) MPO se lie avec avidité à la matrice sous-endothéliale et utilise H ₂ O ₂ pour générer l'oxydant hautement réactif HOCl qui réagit localement avec des protéines de matrice (par exemple, la fibronectine) et perturbe leur la cellule propriétés adhésives. (B) Ces dommages perturbe contacts adhésifs à l'interface cellule-matrice, conduisant à rétraction (C) de la membrane entraînée par la tension à l'unanimité dans le cytosquelette d'actine et la modification de la signalisation cellulaires voies d'adhérence dépendant (Reproduit avec la permission de Rees et al. ⁹ ). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. flux de travail et le principe de l'impédance cellulaire substrat analyses de quantifier cellules endothéliales de-adhérence de la fibronectine en réponse à l'oxydation de la fibronectine MPO-médiation (Expérience 2). valeurs de l'indice cellulaires mesurées par le système cellulaire substrat microarray impédance biocapteur reflètent la capacité de la membrane cellulaire pour limiter les courants ioniques induites par le champ à la surface de l'électrode et sont proportionnelles à la surface de la cellule-contact de substrat ^10. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. quantification en temps réel des cellules endotheliales de-adhérence de fibronectine, en réponse à une oxydation médiée par la fibronectine MPO (Expérience 2). Des suspensions de cellules endotheliales (exempt de sérum dans de Milieu 199 contenant 1%BSA) ont été ensemencées sur de la fibronectine native ou MPO-palier (fibronectine revêtu à 5 g / ml, puis incubées en l'absence ou en présence de 20 nM MPO) dans 96 les tableaux ainsi de microélectrodes (mesures d'impédance cellule-substrat) ou 35 mm à fond de verre des boîtes de culture cellulaire (analyses imagerie des cellules vivantes). Les cellules ont été ensuite incubées à 37 ° C pendant 2 heures pour permettre la fixation cellulaire maximale et la diffusion avant l'équilibrage des cellules avec HBSS et initier l'oxydation de la fibronectine MPO médiée par addition de H ₂ O ₂ (10 uM) (temps de H ₂ O ₂ plus fixé à t = 0 min). (A) la pleine évolution temporelle de mesures d'impédance de la cellule-substrat avant et après le traitement par H ₂ O ₂ en présence (+ MPO) et l'absence (-MPO) de MPO. (B) des mesures d'impédance de la cellule-substrat et (C) la zone cellulaire mesures par imagerie des cellules vivantes analyses, après traitement de cellules contenant de la MPO avec H ₂ O ₂ en présence (+ Blebbistatin) et l'absence (-blebbistatin) de l'inhibiteur de la myosine II blebbistatin (40 M). des valeurs d'index de cellule et la zone cellulaire sont normalisées à des valeurs immédiatement avant le moment de l'H ₂ O ₂ De plus, ce qui a donné une valeur de 1. Les données d'index de cellule représentent la moyenne ± SEM, les mesures n = 6 réplicats provenant d'une expérience représentative. les valeurs de la zone cellulaire représentent la moyenne ± SEM, n = 10 cellules (2 films répétés, cinq cellules sélectionnées au hasard par film: voir des films 1 et 2). (Figure 3B, figure 3C, Film 1 et Film 2 sont reproduits avec l'autorisation de Rees et al. ^9). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Film 1 . Time lapse DIC microscopie de film adhérant sur ​​les cellules endotheliales MPO-palier fibronectine plus de 0 - 15 min après l'exposition à H ₂ O ₂ (10 uM); 1 s = 3 min.

Film 2 . Temps film DIC laps de microscopie de cellules endotheliales adhérant sur ​​MPO-palier fibronectine plus de 0 - 15 min après l'exposition à H ₂ O ₂ (10 uM) en présence de blebbistatin (40 uM); 1 s = 3 min.

L'adhérence cellule-matrice et processus de-adhérence peuvent être quantifiés avec précision en temps réel avec une haute résolution temporelle utilisant une impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches en temps réel fournissent un avantage majeur sur les analyses point final de l'adhésion cellulaire, qui fournissent une mauvaise résolution temporelle. En quantifiant avec précision rapides réponses de-adhésion avec haute résolution temporelle, ces analyses peuvent fournir des informations critiques sur la façon dont morphologique réponses à des modifications de la matrice sont réglementés et leur impact sur ​​les processus de signalisation cellulaire adhérence dépendant, mesurée en parallèle en utilisant des dosages biochimiques pertinents (par exemple, Western blot).

Dans des études récentes, ces approches ont été utilisés pour révéler un nouveau rôle pour la MPO oxydation à médiation de la matrice sous-endothéliale dans le déclenchement de la dé-adhérence des cellules endothéliales et a montré: (i) que le taux d'adhérence de-dépendait essentiellement de pré- actomyosine existantecontractilité (cf. figures 3B et 3C) et (ii) que la perte de cellule-matrice adhérence conduit changements de signalisation cellulaires voies importantes d'adhérence dépendant notamment Src dépendantes phosphorylation de la paxilline et la chaîne légère de la myosine II de phosphorylation ⁹ (voir figure 1). Ces données ont des implications importantes pour la compréhension de la fonction endothéliale et de l'intégrité de la barrière au cours des réponses inflammatoires, où la matrice extracellulaire sous-endothéliale est impliquée comme un objectif clé pour les oxydants produits par des dépôts sous-endothéliaux de MPO lié à la matrice ou d'autres sources d'oxydants réactifs ^{3,5-9, 14.}

L'utilisation d'un système de biocapteur impédance cellule-substrat à base de puces à ADN fournit une plate-forme de solides, à haut débit des mesures d'adhérence cellulaire. Chaque puits du puits cellule-substrat tableaux 96 impédance de microélectrodes a le potentiel d'analyser simultanément 32 conditions expérimentales différentes (ce est à dire, trois puits per condition). Cependant, lorsque l'on compare petits changements dans l'adhésion cellulaire, au moins quatre puits ou plus doivent être utilisés par condition expérimentale. Au cours de l'ensemencement des cellules et des traitements cellulaires ultérieures, il faut prendre soin de garder toutes les solutions à 37 ° C et de minimiser le temps nécessaire pour traiter les cellules en dehors de l'environnement C 37 ° de l'incubateur (cela évite potentiels différences de température à travers la matrice de microélectrodes qui peuvent influer sur les réponses d'adhésion ). En particulier, le courant électrique à l'interface cellule-substrat est sensible à la force ionique du surnageant cellulaire ^10: par conséquent, les cellules sont laissées se équilibrer après l'ajout de nouveaux tampons / médias pour obtenir une réponse de l'indice cellulaire stable avant surveillance de l'effet du stimulus d'intérêt (voir 3.10 et la figure 3A). Diminue l'indice cellulaire peuvent ne pas refléter seulement une diminution de la superficie moyenne de contact cellule-matrice, mais peut aussi refléter une diminution du nombre de cellules attachées. Pour discriminationentre ces possibilités, l'évolution du nombre de cellules fixées sur les réseaux de microélectrodes peuvent être quantifiés immédiatement après les mesures d'impédance cellule-substrat par coloration au violet de cristal cette approche a été utilisée pour confirmer que l'oxydation de la fibronectine MPO médiée déclenche une diminution rapide de la surface moyenne de contact cellule-matrice, mais ne favorise pas le détachement des cellules (pour plus de détails, voir ^9).

Une limitation de la technique de l'impédance cellule-substrat est qu'elle fournit une mesure moyenne de changements d'adhérence sur toutes les cellules présentes sur la surface de la microélectrode et il ne donne pas d'informations sur la nature exacte de l'adhérence ou des changements morphologiques au niveau des cellules individuelles. Pour remédier à cette limitation, cellules vivantes DIC microscopie et l'analyse d'image fournit une mesure complémentaire des changements d'adhérence et révèle des changements morphologiques des cellules individuelles. Ainsi, une diminution de l'indice de cellule en réponse à médiation MPO mea d'oxydation de la fibronectinerée par l'impédance cellulaire substrat (figure 3A) sont bien corrélés avec les diminutions de la surface projetée de cellules mesurées par analyse d'images en direct de la cellule des films DIC (figure 3B). Fait important, les films DIC montrent que, dans des cellules individuelles, MPO induite de-adhérence implique le retrait rapide de la membrane cellulaire périphérique du substrat et les cellules adjacentes et aboutit finalement dans les cellules en supposant une morphologie compacte 'arrondi vers le haut », mais sans qu'il en résulte dans le détachement cellulaire (Film 1). Comme mesures d'impédance cellule-substrat, afin de garantir des réponses cellulaires reproductibles, il faut prendre soin de maintenir des solutions à 37 ° C avant de l'utiliser sur des cellules et une platine de microscope chauffée (ou dispositif de contrôle de la température équivalente) doivent être employées lors de l'imagerie des cellules vivantes enregistrements.

Les protocoles décrits ici peuvent être modifiés facilement en substituant la fibronectine avec d'autres substrats de la matrice purifiée ( Par exemple, du collagène ou de la laminine) ou l'étude d'un environnement matriciel des heures supplémentaires plus complexe produite par les cellules adhérentes cultivées (pour plus de détails, voir ^9). Les protocoles peuvent également être modifiées en substituant l'oxydation de la matrice MPO induite par d'autres stimuli solubles qui perturbent cellule-matrice adhérence y compris d'autres oxydants de matrice modificateurs physiologiques (par exemple, le peroxynitrite, le dioxyde d'azote radical ^5-8), des proteases dégradant la matrice ¹⁵ ou antagonistes des ligands d'adhésion présentes à la surface cellulaire ou dans la matrice (par exemple des anticorps anti-intégrine ou des peptides RGD). Les analyses en direct d'imagerie cellulaire peuvent également être utilisés pour quantifier des cellules de matrice d'adhérence en réponse à la désorption électrochimique des contacts cellule-matrice ^16. Enfin, les protocoles décrits sont également facilement applicable à l'étude de la dynamique d'adhésion cellulaire dans les cellules adhérentes autres que les cellules endothéliales (par exemple, les cellules épithéliales).

Les auteurs ne ont aucune divulgation à faire.

This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).