Différenciation d'un Neural Stem Cell humaine ligne sur Trois Cultures dimensionnelles, les gènes Analyse des microARN et Putative cibles

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Les cellules souches neurales (NSC) sont capables de se auto-renouvellement et de différenciation en neurones, astrocytes et oligodendrocytes sous microenvironnements locaux spécifiques. Ici, nous présentons un ensemble de méthodes utilisées pour trois dimensions (3D) la différenciation et l'analyse miARN d'une cellule souche neurale humaine (hNSC) lignée clonale, actuellement en essais cliniques de l'AVC handicap (NCT01151124 et NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs ont été obtenues à partir d'un premier trimestre cortex fœtal humain approuvé éthique et conditionnellement immortalisés en utilisant l'intégration rétrovirale d'un seul exemplaire de la c-MycER ^TAM construire. Nous décrivons comment mesurer processus de croissance axonale des hNSCs différenciés sur des échafaudages 3D et comment quantifier les changements dans l'expression des miARN associés utilisant tableau PCR. En outre, nous illustrons l'analyse informatique dans le but de sélectionner miARN cibles potentielles. SOX5 et NR4A3 ont été identifiés comme miRNA cible supposée appropriée de manière significative sélectionnée réguler à la baissemiARN dans d hNSC différenciée. La validation des cibles miARN a été réalisée sur SOX5 et NR4A3 3'UTRs par une double transfection journaliste de plasmide et dosage de la luciférase double.

la recherche sur les cellules souches joue un rôle central dans la médecine régénérative, qui se étend également les disciplines de l'ingénierie tissulaire, la biologie cellulaire développementale, thérapeutiques cellulaires, la thérapie génique, et biomatériaux (échafaudages et matrices). Les cellules souches sont importantes à la fois dans la réparation des tissus organe de Développementet; comprendre comment les cellules souches travaillent est essentielle pour le développement de traitements basés sur les nouvelles cellules souches ^1. CTX0E03 est un clonale, cellules conditionnellement immortalisées souche neurale humaine (hNSC) ligne ² isolé du premier trimestre cortex fœtal humain. CTX0E03 a défini les caractéristiques de qualité qui sont essentiels pour les banques de cellules cliniques dans de bonnes pratiques de fabrication (BPF) ^3. HNSCs peuvent spontanément se différencier en neurones, les cellules gliales, et les oligodendrocytes et ont fait leurs preuves pour améliorer les déficits neurologiques lorsqu'elles sont transplantées dans un modèle de rongeur de l'ischémie focale ^2,4,5. Le CTX0E03 hNSCs sont actuellement en essais cliniques de l'AVC handicapslité (NCT01151124 ⁶ et NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

MiRNAs ont une moyenne de 22 nucléotides de longueur et sont prouvés molécules régulatrices ^7, ils ne codent pour des protéines, mais plutôt lier 3 Premier région non traduite (3'UTR) des ARNm, la régulation de leur stabilité et leur traduction en protéines. MiRNAs sont signalés à participer à la régulation d'un certain nombre de processus cellulaires, y compris le développement, la prolifération et la différenciation ^8. Plusieurs miARN ont été impliqués dans la régulation du sort et la spécification des cellules souches neurales ^9.

Dans deux dimensions (2D) milieu de culture standard la complexité de l'environnement in vivo ne correspond pas, et par conséquent l'induction et la régulation de la différenciation hNSC ne est pas optimale. In vivo, les cellules sont entourées par un dimensions (3D) microenvironnement trois composés par d'autres cellules et des ligands extracellulaires, dont beaucouples types de collagènes, la laminine et d'autres protéines de la matrice (matrice extracellulaire, ECM). Des études antérieures ont rapporté que la topographie architecturale des matériaux imitant ECM et leur phénotype cellulaire géométrie de l'influence et le destin ^10-15. Un certain nombre d'échafaudages 3D disponibles dans le commerce sont disponibles; nous avons utilisé un échafaudage de polystyrène hautement poreux conçu avec une architecture bien défini et uniforme dans une membrane épaisse de 200 um qui fournit un espace 3D en cellules qui peuvent envahir et différencier ^16-18.

Herein 2D et 3D dosages de différenciation sont utilisés pour évaluer axonprocess excroissance. En outre, nous décrivons une méthode pour profiler l'expression des miARN d'une ligne de hNSC de qualité clinique pour étudier davantage les effets miRNA sur sa différenciation. Les méthodes illustrées ici sont basées sur celles décrites dans ¹⁹ l'origine.

1. différenciation HNSC sur tridimensionnelle (3D) Culture

REMARQUE: Isoler et tirer hNSCs, à partir d'un tissu approuvé éthique, décrit dans une publication précédente ^2. Se il vous plaît suivre les lignes directrices éthiques et institutionnels tout en suivant cette procédure.

1.1) 3D culture en utilisant 12 puits Plaque

1. Utiliser une technique aseptique pendant la procédure. Dans une enceinte de sécurité biologique, réhydrater les échafaudages en ajoutant 2 ml / puits de 70% d'éthanol préparés avec de l'eau pour l'irrigation (WFIr). Evitez de toucher les échafaudages en distribuant l'éthanol à 70% dans la muraille de chaque puits.
2. Aspirer soigneusement le éthanol à 70% et se laver immédiatement les échafaudages avec 2 ml / puits DMEM: F12 pendant 1 min. Répéter deux fois la procédure de lavage. Aspirer soigneusement le DMEM: F12 après le lavage final.
3. Manteau échafaudages en ajoutant 2 ml / puits de la laminine (10 pg / ml) dans du milieu DMEM: F12. Incuber la plaque à 37 ° C dans un CO ₂ hum 5%idified incubateur pendant au moins 2 heures. Laver la plaque avec du DMEM chaud: F12.
4. Ensemencer chaque échafaud avec environ 500 000 hNSCs dans un volume de 150 pi de RMM + GF.
5. Incuber la plaque pendant 3 heures à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 humidifié 5% pour permettre aux cellules de se installer dans les échafaudages.
6. Ajouter 3,5 ml de RMM à chaque prenant bien soin de ne pas déloger les cellules à partir des échafaudages.
7. Incuber la plaque pendant 7 jours; remplacer à moyen RMM (3,5 ml / puits) après un jour (la première alimentation) et à nouveau après 2-3 jours de la première tétée.
8. Après sept jours, éliminer le milieu et fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) pour immunocytochimie (ICC) ou ajouter 500 ul / puits de réactif de lyse pour l'extraction de l'ARN total (plaque de stocker à ≤ -80 ° C ou de procéder à l'extraction de l'ARN total) .

1.2) Mesure de Axon processus Excroissance

1. Tache PFA 4% fixé hNSCs différenciées selon un protocole type CCI ²⁰ en utilisant de β3-tubuline (TUBB3) d'anticorps primaire détectée avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome. Noyaux cellulaires Counterstain avec Hoechst (1 uM).
2. Capturez des images représentatives de cellules colorées β3-tubuline en utilisant un microscope à fluorescence; enregistrer des images au format TIFF ou JPEG. Mesure de processus de croissance axonale aide d'un outil de mesure du logiciel (par exemple Image-Pro Plus).
3. Ouvrez l'image, sélectionnez l'option des mesures dans la barre d'outils, et sélectionnez la fonction de trace.
4. Pour démarrer la trace, sélectionnez le point de départ sur l'excroissance des axones en cliquant sur le bouton de la souris. Tracer sur toute la longueur de l'excroissance des axones; clic droit pour terminer chaque trace. Répétez l'opération pour mesurer toute outgrowthswith des axones dans le champ de vision.
5. Exprimez-mesures comme des pixels ou pm (en attendant l'étalonnage mis en place). les mesures de longueur de l'exportation vers un tableur pour l'analyse comparative et statistique échantillon.

2. Utilisation d'un miARN Expression cellules souches etVoies de développement ciblée tableau miRNA PCR

2.1) miRNA extraction de l'ARN total

1. Effectuer l'extraction miRNA sur des échafaudages et des échantillons cultivés 2D (différenciés et non différenciés, le contrôle hNSC).
2. Échafaudages dégel, insérés dans une plaque à 12 puits, si nécessaire. Combinez les contenus de réactifs de lyse (500 pi) de deux puits dans le même tube Eppendorf de 1,5 ml, volume final de 1 ml de réactif de lyse. Prenez soin de laisser l'échafaud dans le puits.
3. Pour 2D grandi échantillons prélevés antérieurement secs granulés cellulaires (cultures hNSC 2D différenciées et de contrôle indifférencié) ajouter 1 ml de réactif de lyse et transférer le contenu dans 1,5 ml microtube.
4. Homogénéiser chaque échantillon d'essai en utilisant une seringue de 1 ml et une aiguille de calibre 20 à 25 court. Faire passer le lysat à travers l'aiguille en utilisant une seringue de 1 ml jusqu'à 5 fois jusqu'à ce qu'un lysat homogène.
5. Ajouter 200 pi de chloroforme à chaque tube Eppendorf et bouchon. Inverser tubes vortex et àmélanger le contenu.
6. Centrifugeuse contenant chacun de 1,5 ml homogénat de microtube pendant 15 min à ≥12,000 x g.
7. Transférer la phase aqueuse supérieure de chaque échantillon (éviter de transférer toute interphase, rose liquide de couleur) à un tube de 1,5 ml frais contenant 750 pi d'éthanol à 100%. Mélanger soigneusement par inversion.
8. Pipeter jusqu'à 700 ul de chaque échantillon d'essai, y compris tout précipité, en une mini colonne dans un tube collecteur de 2 ml. Fermer le couvercle et centrifuger à ≥8,000 g pendant environ 30 secondes à la température ambiante. Jeter le accréditives. Répéter cette étape en utilisant le reste de l'échantillon.
9. Effectuer un condensé ADN pour 15 min.
10. Ajouter 700 ul RTT tampon au mini colonne et centrifuger pendant environ 30 secondes à ≥8,000 x g. Jeter le accréditives.
11. Laver mini-colonne en ajoutant 500 pi de tampon RPE et centrifugation pendant environ 30 secondes à ≥8,000 x g. Jeter le accréditives. Répétez wash.Centrifuge au ≥12,000 g pendant 1 min à sécher la membrane plus loin.
12. Eluer l'ARN total dans un tube Eppendorf de 1,5 ml en ajoutant 40 ul d'eau exempte de RNase à la mini-colonne et la centrifugation pendant 1 min à ≥8,000 x g. Mesurer la concentration de l'ARN total à l'aide d'un spectrophotomètre approprié.

2.2) ADNc miRNA Préparation

1. Préparer le mélange maître inverse de transcription. Chaque échantillon nécessite 4 pi de tampon 5x miScript Hispec, 2 pi de 10x nucleics mélange, 2 pl miScript transcriptase inverse mélange.
2. Aliquote 8 pi de mélange maître dans un tube PCR, ajouter du volume requis de l'ARN total (250 ng) et ajouter de l'eau exempte de RNases à un volume final de 20 pi.
3. Incuber pendant 60 min à 37 ° C.Incubate pendant 5 min à 95 ° C pour inactiver la transcriptase inverse miScript Mix.
4. Ajouter 200 eau libre de RNase-ul à chaque réaction 20 pi transcription inverse, conserver à -20 ° C, ou de procéder avec de la vraie-time PCR immédiatement.

2.3) Les cellules souches et les voies de développement ciblé tableau miRNA PCR

1. Préparer le PCR composants mélange dans un tube de 15 ml en ajoutant 1 375 pi de 2x SYBR maître vert mélange, 100 ul miRNA ADNc préparation, 275 pi de 10x Primaire universel miScript et 1000 ul d'eau sans RNase (volume total de 2 750 pi).
2. Transfert PCR composants mélange sur un réservoir de chargement PCR. Retirez délicatement le 96 puits tableau plaque PCR de son sac scellé.
3. Ajouter 25 ul composants de mélange PCR dans chaque puits de la matrice PCR en utilisant une pipette à 8 canaux, ou d'une pipette 12 canaux avec seulement 8 conseils. Changer conseils pipette après chaque étape de pipetage pour éviter la contamination croisée entre les puits.
4. Sceller la plaque avec un film adhésif optique, et centrifuger pendant 1 min à 1 000 g à température ambiante (15-25 ° C) pour éliminer les bulles. Inspecter visuellement la plaque de dessous pour se assurer qu'aucun des bulles sont présentes dans les puits.
5. Placez le tableau PCR 96 de la plaque et dans le temps réel cycleur.
6. Programme en temps réel en conséquence cycleur: 1 cycle à 95 ° C pendant 10 min, et 45 cycles pour 15 s à 95 ° C, et 1 min à 60 ° C réglé une seule (la collecte des données de fluorescence).
7. Exporter les valeurs de Ct pour tous les puits à une feuille de calcul Excel vide pour une utilisation avec matrice PCR Analyse des données modèle Excel et le logiciel basé sur le Web.
   REMARQUE: Le logiciel est disponible au www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php .

3. Analyse computationnelle pour miRNA prévision cible et validation de la cible ARNm par Reporter plasmide transfection et Ddual Luciferase Assay.

3.1) Analyse informatique de prévision miRNA cible

1. Parcourir PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) ^21, l'algorithme disponible en ligne pour l'identification de miRNA ARNm cible de prédiction.
2. Cliquez sur "cliquez ici pour la prédiction PicTar sur les vertébrés". Une nouvelle page se ouvre.
3. Dans la nouvelle page, interface web PicTar, choisir des espèces dans le menu déroulant et insérez miARN d'intérêt dans la zone miRNA ID. Cliquez recherche de cibles d'un miARN.
4. Observez la liste des ARNm cibles selon leur indice de pointage aPicTar.
   REMARQUE: PicTar calcule un score reflétant la probabilité qu'un UTR donnée sera ciblée par le miARN choisi, et basé sur la complémentarité des semences, la thermodynamique et une prédiction combinatoire pour des objectifs communs dans des ensembles de miARN de co-exprimées ^22.
5. Liste des ARNm cibles récupérer même en utilisant DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) ^23, et TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) ^24, alternative en ligne disponible algorithmes.
6. Compiler un tableau comparatif des mARNi basée sur le classement obtenu en utilisant différents outils logiciels. PicTar classe par le score, DianaLab par spécificité (basé sur le rapport signal sur bruit et un score de précision pour l'évaluation de l'importance des résultats prévus), et TargetScan par le PCT globale (basée sur la complémentarité des semences, Énergie libre de se lier, conservation plus espèces différentes), voir tableau 1.

3.2) Validation de la cible ARNm par Reporter plasmide transfection et Dual Luciferase Assay.

NOTE: 3 'UTR reporters de luciférase pour la validation de la cible ARNm a été décrit précédemment ^25.

1. Transfection
   1. Semences cellules HeLa à une densité de 10 ⁵ cellules / puits dans une plaque de 24 puits.
   2. Après 24 h, co-transfecter des cellules HeLa avec 1,5 ul de réactif de transfection et, soit 100 ng de plasmide NR4A3 UTR 3 'Utror SOX5 3', ainsi que 20 nM imite miRNA (hsa-miR-96-5p pour SOX5 3217; UTR, et HSA-miR-7-5p, et HSA-miR-17-5p pour NR4A3 3 'UTR respectivement) par puits.
   3. Puits de contrôle co-transfecter avec NR4A3 3 'Utror SOX5 3' UTRplasmid et fluorochrome marqué siRNA contrôle négatif. La transfection de puits de contrôle avec fluorochrome marqué négatifs siRNA de contrôle permet d'évaluer l'efficacité de transfection et représente synoptique miRNA 3'UTR spécificité de liaison.
2. Mesure de la double activité luciférase
   1. Mesurer les activités de la luciférase de luciole et de Renilla 24 heures après transfection. Éliminer le milieu de croissance cellulaire.
   2. Préparer la solution de travail I en ajoutant 50 pl de substrat I dans 10 ml de solution I; bien mélanger. Ajouter 300 pi de solution de travail I dans chaque 24 puits.
   3. Transférer le contenu de chaque 24 bien dans trois puits d'une plaque blanche, 96 100 pi chacun. Attendre 10 min et mesurer Firefly luciférase dans le jeu de luminomètre pour l'acquisition de luminescence.
   4. Préparer solut travailion II par addition de 50 ul de substrat II dans 10 ml de solution II; bien mélanger. Ajouter 100 pi de solution de travail I dans chaque 96 puits contenant déjà 100 pi de solution de travail I.
   5. Attendre 10 min et mesurer la luciférase de Renilla dans le jeu de luminomètre pour l'acquisition de luminescence. Calculer le rapport de la luminescence de la luciférase Firefly à la luciférase Renilla.

Sur la figure 1 est visualisé l'enquête et la quantification de la différenciation hNSC sur des échafaudages 3D par rapport à des cultures traditionnelles de surface planes (2D) et expressedas axone mesures de processus excroissance. Dans la figure 2 est representedthe flux de travail et les résultats pour la quantification miRNA utilisant des cellules souches et les voies de développement axées tableau miRNA PCR pour étudier l'expression différentielle des miARN dans 2D et 3D hNSCs différenciées par rapport à un contrôle indifférencié. Suite à l'analyse comparative entre les miARN hNSCs différenciés et non différenciés, et une analyse informatique pour la prédiction de cible, SOX5 et NR4A3 (NOR1) ont été identifiés comme ARNm cibles putatifs. Pour étudier l'interaction directe entre les miARN et leur site putatif sur l'ARNm 3'UTR nous avons utilisé deux plasmides disponibles dans le commerce contenant soit SOX5 ou la séquence 3'UTR NR4A3 insérés en aval du gène rapporteur de la luciférase de luciole, un nd contenant dans le même gène de la luciférase de Renilla plasmide pour la normalisation. Les résultats représentatifs de la 3 'UTR activité luciférase régulation à la baisse est présentée en figure 3.

Figure 1:. Différenciation des hNSCs sur échafaudages 3D, et la mesure de l'excroissance de axone procédé (A) Après la coloration ICC standard pour β3-tubuline (vert) et des noyaux de contraste avec Hoechst (bleu) microphotographies représentatives ont été acquis et la mesure des processus d'axones étaient effectuée à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image. (B) Diagrammes déclaré la mesure du processus de la croissance axonale réalisée en 2D et 3D hNSCs différenciés pour une (1W) ou 3 semaines (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2:. Flux schématique de miARN profilage hNSCs différenciées d'ARN total, y compris les miARN, a été extrait de soit hNSCs différenciées sur échafaudages 3D et 2D standard, cultures ou le contrôle indifférencié. 250 ng d'ARN totaux ont été rétro-transcrit avec une méthode qui facilite la conversion sélective des miARN matures en ADNc approprié pour miRNA quantification avec une différenciation de cellules humaines et le développement tableau miScript miRNA PCR. La géo-moyenne de SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A et RNU6-2 a été utilisé pour l'analyse des données sur la base de la méthode 2 ^{de -ΔΔct.} Des changements importants ont été définis comme +/- 1,5 plier et régulation à la baisse à un stamesure statistiquement significative. Les données ont été analysées avec le logiciel disponible sur le Web au résultats sont exprimés en tant que clustergram. Modifié à partir de la figure 3 ^19. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Validation de la cible miRNA prédit ARNm en utilisant une double luciférase rapport dosage. (A) diagramme représentant d'une double plasmide rapporteur luciférase utilisé comme un outil pour valider la séquence 3'UTR comme une cible directe d'un miARN. (B) micrographie représentant montrant l'efficacité de transfection. (C)   Signaux, exprimés en activité luciférase relative, d'humain 3 & #39 journalistes; UTR ofSOX5 et NR4A3 gènes étaient significativement renversé en présence de HSA-miR-96 et miR-hsa-sept et 17 imite miRNA respectivement. Modifié à partir de la figure 5 ^19. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Liste des miRNA ARNm de prédiction de cible. Tableau représentant des miARN, cibler les gènes prédictifs, et l'analyse des algorithmes (prévoirion / partition / global fourni en utilisant Diana Lab, PicTar et TargetScan respectivement). Modification du tableau 3 ^19.

Le développement de nouveaux tests in vitro pour évaluer et améliorer la différenciation des cellules souches a toujours présenté un défi pour l'enquête de leurs fonctionnalités et les capacités thérapeutiques. À long terme et la fixation stable de hNSCs, nécessaire pour le développement d'un test 3D robuste de différenciation in vitro, a été abordée en testant plusieurs substrats 3D avec des caractéristiques différentes en termes de matériaux et des structures. Dans le cadre du développement de tests nous avons également évalué la concentration optimale de l'ensemencement des cellules et identifié l'obligation pour les échafaudages à la laminine enrobés. Bien que nos hNSCs peuvent se différencier spontanément sur 4-OHT et enlèvement facteur de croissance, la mise en oeuvre d'un système de culture 3D a montré une amélioration significative de leur capacité de différenciation, telle que mesurée par l'excroissance axonale processus par rapport à hNSCs 2D différenciée standard.

Pour étudier l'effet de 3D différe induitentiation sur l'expression des miARN hNSC nous avons utilisé un tableau PCR. Comparé à puce à puce norme tableau PCR offre les avantages d'une quantification directe et la validation des miARN d'intérêt. Bien que le tableau PCR est limitée en terme de nombre total de miARN par baie, par exemple ici moins de 96, il peut être adapté afin d'inclure expressément miARN d'intérêt, dans notre cas précédemment signalé dans le développement de cellules souches. L'expression de la voie axée miARN a été présenté dans 3D et 2D hNSCs différenciés par rapport aux hNSCs indifférenciées. Les miARN plus significativement régulés à la baisse ont été sélectionnés et analysés pour évaluer leurs ARNm cibles putatifs avec l'intention de déterminer leur fonctionnalité et leur interprétation biologique en utilisant des algorithmes disponibles en ligne (DIANA Lab, PicTar et TargetScans).

Un seul miARN peut reconnaître des centaines de cibles et pour cette raison nous avons validé les interactions miARN avec 3 'UTR mRNAsthat peuvent être candidats appropriés dans unla réglementation xonal. NR4A3, une cible de la hsa-miR-7, et miR-17 la famille, est un membre des récepteurs nucléaires de la famille de NR4A qui, en fonction de leur niveau d'expression, sont impliqués dans la différenciation, la survie, l'apoptose et la régulation des axone hippocampique ²⁶ conseils. De même SOX5, un objectif de hsa-miR-96, est signalé à contrôler la progression du cycle cellulaire dans progéniteurs neuronaux ²⁷ de longueur des axones ^28, migration, différenciation post-migratoire, et les projections de neurones ^29. Les deux SOX5 et NR4A3 ont été identifiés comme un ARNm cible directe de hsa-miR-96 et miR-hsa-7 et 17 respectivement par deux dosages luciférase rapporteurs. Double luciférase (Renilla et Firefly) se appuie sur deux gènes rapporteurs différents dans le même plasmide et propose un système perfectionné permettant la normalisation pour les effets causés par transfection sous-optimale et des effets cytotoxiques par rapport à un unique système de plasmide luciférase. Dans le cadre de notre développement de tests, nous avons également optimisé notre conditi de transfectionons afin d'obtenir un rendement élevé.

Le protocolsdescribed ici peut être exploitée pour optimiser et caractériser la différenciation in vitro hNSC qui peut beimplemented protocoles de intransplantation pour les études pré-cliniques et futures applications cliniques.

Tous les auteurs sont détenteurs de stock-options dans ReNeuron Ltd ou sa société mère employés, stock et / ou. Cette étude a été soutenue par ReNeuron (RENE.L).

Nous reconnaissons Julie Heward pour aider dans la préparation de hNSCs et Lavaniya Thanabalasundaram pour son soutien technique avec HeLa culture et la transfection.