Isolement de CA1 nucléaires enrichies fractions de coupes d'hippocampe pour étudier l'activité dépendante nucléaire importation de Synapto nucléaires protéines Messenger

Nous fournissons un protocole détaillé pour l'induction de la potentialisation à long terme dans la région CA1 de l'hippocampe et l'isolement subséquent de fractions enrichies à partir de la zone nucléaire tétanisée de la tranche. Cette approche peut être utilisée pour déterminer l'activité dépend énormément des importations de protéines nucléaires dans des modèles cellulaires de l'apprentissage et de la mémoire.

Étude de l'expression de l'activité de la protéine dépendante, translocation subcellulaire, ou la phosphorylation est essentiel de comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents de la plasticité synaptique. Potentialisation à long terme (LTP) et la dépression à long terme (LTD) induite dans des coupes d'hippocampe aigus sont largement acceptés comme modèles cellulaires de l'apprentissage et de la mémoire. Il existe de nombreuses études qui utilisent l'imagerie cellulaire ou immunohistochimie approches vivantes de visualiser la dynamique des protéines dépendantes de l'activité. Cependant, ces méthodes reposent sur la pertinence d'anticorps pour immunocytochimie ou surexpression de protéines par fluorescence marqués dans les neurones simples. Immunoblotting des protéines est une méthode alternative fournissant une confirmation indépendante des résultats. Le premier facteur limitant dans la préparation de fractions subcellulaires de tranches d'hippocampe tétanisés individuelles est la faible quantité de matière. D'autre part, la procédure de traitement est cruciale, car même les manipulations très courtes et mineures de la vie des tranches peut induire l'activation de certaines cascades de signalisation. Nous décrivons ici un flux de travail optimisé afin d'obtenir une quantité suffisante de la fraction nucléaire enrichi d'une pureté suffisante de la région CA1 de l'hippocampe aiguës tranches de cerveau de rat. A titre d'exemple représentatif, nous montrons que la ERK1 / 2 sous forme phosphorylée de la protéine messager de synapto-Jacob translocation nucléaire activement au noyau lors de l'induction de la LTP et peut être détectée dans une fraction enrichie nucléaire de neurones CA1.

Synaptic N-méthyl-D-aspartate-récepteurs (récepteurs NMDA) jouent un rôle crucial dans la plasticité synaptique et la survie des cellules de signalisation alors que l'activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques peut déclencher la neurodégénérescence et la mort cellulaire. Ces variations dépendent de l'expression des gènes dépendant / d'activité régulée étroitement contrôlé et donc nécessitent une communication constante entre les synapses ou dendrites activées et le noyau ^7. Le MAP kinases ERK1 / 2 sont des effecteurs en aval de récepteurs NMDA synaptiques de signalisation et sont impliqués dans l'expression des gènes NMDAR-activation induite, alors que la signalisation via NMDAR extrasynaptique n'a aucun effet ou un effet inhibiteur sur ERK1 / 2 activités ^8,11.

Il existe un certain nombre de protéines qui ont été montrés pour faire la navette entre les dendrites distales et le noyau. Beaucoup de ces protéines contiennent un signal de localisation nucléaire et sont activement transportés le long de microtubules dans un dynéine et de manière dépendante importin au noyau ^6,9. Interestingly, certains seulement de ces messagers transit vers le noyau en réponse à des stimuli spécifiques synaptiques. Par exemple, le transport rétrograde de cyclique élément de réponse AMP protéine de liaison à 2 (CREB2) est induite par LTD chimique mais non LTP ^12. Localisée stimulation synaptique NMDAR dépendant entraîne co-activateur transcriptionnel CREB réglementés (CRTC1) dans le noyau, un processus de translocation, qui est impliquée dans la plasticité de l'hippocampe à long terme ^4. Il a été récemment montré que le messager de la protéine Jacob translocation vers le noyau après l'autre, l'activation des récepteurs NMDA synaptiques et extrasynaptique et régule CREB gène transcription dépendante ^5. L'origine synaptique ou extrasynaptique du signal est encodé dans une modification post-traductionnelle de Jacob. Activité synaptique induit ERK1 / 2 dépend de la phosphorylation de Jacob à une serine en position 180 cruciale (pJacobS 180) qui est une condition nécessaire pour la translocation vers le noyau ultérieur en culture primaire d'hippocampe. De plus, in neurones CA1 de 180 translocation de tranches d'hippocampe aigus vers le noyau après Schaffer garantie LTP mais pas LTD ^1,10. PS180 Jacob conduit à une augmentation de l'expression des gènes de plasticité liée et cette expression de gène réinjecte de la fonction synaptique. À l'opposé, Jacob translocation vers le noyau après NMDARs extrasynaptiques activation n'est pas phosphorylée au niveau de Ser180 et peut être associé à différentes complexe protéique dans le noyau provoquant 'CREB arrêt' et une rétraction des contacts synaptiques ^10.

La plupart des études publiées sur l'importation nucléaire de la protéine messager synapto-nucléaire ont été réalisées dans des cultures primaires de neurones dissociés. Par conséquent, il serait intéressant de voir si ces résultats peuvent être reproduits dans physiologiquement plus pertinent conditions en utilisant des coupes d'hippocampe où la connectivité et la fonction neuronale sont beaucoup mieux conservées. Nous présentons ici un protocole optimisé pour évaluer LTP-dependants translocation nucléaire de messagers de protéines par immuno. Ce procédé convient également pour l'analyse de l'activité de phosphorylation dépendant de protéines dans une fraction nucléaire brut. Plus précisément, le protocole actuel consiste à préparer des aigus tranches CA1 de l'hippocampe, de l'induction, et l'enregistrement de la LTP. Ensuite, région CA1 est disséqué au microscope à isoler la région stimulée. Nous avons combiné et modifié le protocole pour l'isolement nucléaire fourni par CellLytic nucléaire Extraction Kit avec modifications introduites par Zhao et ses collègues ^17. La procédure optimisée comprend la lyse des régions CA1 disséqués dans un tampon hypotonique permettant gonflement des cellules et la libération des noyaux. La lyse des cellules et la morphologie des noyaux peuvent être déterminés par l'examen microscopique. Enrichissement nucléaire est réalisé par une étape de centrifugation de courte. Analyse immunoblot avec des anticorps contre NeuN et NSE2, les marqueurs spécifiques de fractions cytosoliques ou nucléaires, indique que cette approche peut être utilisée comme un jeûneet le protocole reproductible d'isoler ces fractions subcellulaires et d'étudier modifications post-traductionnelles très labiles comme la phosphorylation des protéines. En outre, ce procédé est avantageux pour de petits échantillons de tissus provenant des régions CA1 de tranches d'hippocampe disséqué et peut être utilisé en combinaison pour l'immunohistochimie de coupes d'hippocampe.

1 Préparation de aiguë coupes d'hippocampe de cerveau de rat adulte

1. Anesthésier les rats avec de l'isoflurane. ATTENTION: Effectuer la procédure en utilisant un dessiccateur fermé, ne pas inhaler isoflurane. Assurez-vous que l'animal est complètement anesthésié.
2. Décapiter le rat, isoler rapidement le cerveau, et la plonger dans précarbonaté (95% O _2/5% de CO mélange gazeux ₂₎ glacé la solution de Gey (composition en mM: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O , 0,3 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 11 MgCl ₂ · 6H ₂ O, 0,23 KH ₂ PO _4, 0,8 Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O, 5 Glucose · H ₂ O, 25 HEPES, 22 NaHCO _3, pH 7,32) pendant 30 min ^1,2,10,16.
3. Retirez le cervelet et une partie du cortex entorhinal. Séparez les hémisphères corticaux avec une coupe mi-sagittal, puis placez chaque hémisphère vers le bas sur sa surface interne. Par la suite, faireune réduction de 50 à 70 ° (de 50 à 70 ° transversal) le long de la partie dorsale de chaque hémisphère ^13,14.
4. Collez chaque hémisphère de la surface fraîchement coupée sur la plate-forme de découpage du système de découpe. La plate-forme devrait être couvert par la solution de Gey glacée precarbogenated.
5. Couper 350 um de 50 à 70 ° tranches transversales de côté avant vers l'arrière en utilisant un vibratome ajustés pour minimiser l'oscillation de l'axe z. La formation de l'hippocampe, le cortex entorhinal et subicular, ainsi que les cortex dorso-latérale qui se trouvent à l'hippocampe feront partie des tranches utilisées pour les expériences ^13,14.
6. Transfert des coupes d'hippocampe de forme de U et submergé de type incubateur et incuber pendant au moins 2 heures à 32 ° C avec du liquide céphalorachidien artificiel carbogenated (ACSF contenant en mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 _CaCl2 · 2H ₂ O, 1,5 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 1,24 KH ₂ PO _4, 10 Glucose · H ₂O, 27,4 NaHCO _3, pH 7,3) ^1,2,10,16.

2 Positionnement des électrodes, de base d'enregistrement, et l'induction de la LTP

1. Transférer la tranche de l'hippocampe à une chambre d'enregistrement du type immergé monté sous un microscope. Perfuser (6-7 ml / min) avec ACSF carbogenated pendant au moins 30 min à 32 ° C.
2. Préparer microélectrodes capillaires en verre remplis d'ACSF (résistance à la pointe est de 3-5 MQ).
3. Placez un verre rempli de microélectrodes ACSF dans les fibres CA1 Schaffer-garantie pour la stimulation et à la radiatum CA1 de strate pour fEPSP enregistrement ^1,2,10 (figure 2). La distance entre les électrodes doit être d'environ 300 um.
4. Évocation champ excitateurs post-synaptiques potentiels (fEPSPs) par stimulation des fibres Schaffer-accessoires avec des impulsions de courant rectangulaires biphasiques (200 ms / polarité) dans une gamme de 3-4 V.
5. Effectuer le test de stimulation maximale par mesure de l'INPrelation ut-sortie et de définir la force de stimulation de 40% des valeurs fEPSP pente maximales obtenues et garder constante tout au long de l'expérience.
6. Commencer l'enregistrement de base pendant au moins 15 minutes après le test de stimulation maximale. Mesurer les réponses à des stimuli tester toutes les minutes pendant toute l'expérience. Effectuer des enregistrements de base avec la stimulation de basse fréquence.
7. Notez la ligne de base pendant au moins 30 min.
8. Pour la fin LTP induction s'appliquer à haute fréquence 100 Hz tétanisation composé de trois trains de relance 1 sec à 100 Hz avec un intervalle intertrain 5 min. Pour augmenter le champ de stimulation dans CA1 région 5 uM bicuculine peuvent être lavés en 2 min avant tétanisation et doivent être lavés immédiatement après la dernière tétanisation.

3 Collection de tranches après induction de la LTP et Snap congélation

1. Arrêter l'enregistrement LTP 2 min ou 30 min après trois trains de stimulation tétanique induisant Late-LTP.
2. Retirez les électrodes et rapidement transférer la tranche sur une plate-forme métallique precold placé sur de la glace sèche. Répétez la procédure pour une tranche de contrôle gardé dans un incubateur en forme de U. ATTENTION: Utiliser des gants tout en travaillant avec de la glace sèche.
3. Recueillir chaque tranche dans un tube de 1,5 ml et conserver à -80 ° C.

4. isolement de fractions enrichies nucléaires de la région CA1 de l'hippocampe

1. Prenez tubes de 1,5 ml Eppendorf avec les tranches congelés de -80 ° C et de les garder sur la glace.
2. Ajouter 0,5 ml de tampon contenant la protéase fraîche SCT (PI) et la phosphatase (PS) inhibiteurs, dans le tube. Incuber pendant 2-3 min et transférer à un microscope stéréoscopique. ATTENTION: Utiliser des gants de protection et une blouse de laboratoire tout en travaillant avec PI et PS.
3. Disséquer la région pyramidale CA1 de l'hippocampe de strate au moyen de deux aiguilles. Utilisez une aiguille pour la tenue de la tranche sous la loupe binoculaire et la seconde aiguille pour couper la zone CA1.
4. Recueillir le CA disséquéUne région de cinq tranches (pour chaque groupe) dans un nouveau tube de 1,5 ml contenant un tampon de lyse de 50 ul (1 x tampon de lyse hypotonique contenant en mM: 10 HEPES, 1,5 _MgCl2, 10 KCl, pH 7,9, avec PI et PS). Notez que cette quantité de matière sera suffisante pour faire fonctionner 2-3 immunoblots.
5. Homogénéiser tissus prélevés par prudent pipetage de haut en bas. Utiliser une pipette de 200 pi. Faire incuber le lysat sur de la glace pendant 5-7 minutes pour permettre aux cellules de se gonfler.
6. Prendre 2 pl du lysat, déposez-les sur une lame de microscope, et de visualiser le gonflement des cellules sous un microscope en champ lumineux. Avec gonflement correct des cellules les noyaux apparaissent comme des structures intactes ronde.
7. Recueillir 20 ul d'échantillon dans un tube de 1,5 ml frais de «fraction homogénat. Ajouter 8 pi de dénaturation tampon d'échantillon SDS 4x.
8. Centrifuger les lysats restants à 11000 rpm pendant 1 min.
9. Recueillir soigneusement le surnageant par le haut («fraction cytosolique), transfert dans un nouveau tube et ajouter 20 ul de tampon d'échantillon 4x.
10. Reprendre le culot dans 60 ul de tampon hypotonique et ajouter 20 ul de tampon d'échantillon 4x. Cette fraction est appelée «fraction enrichie nucléaire.
11. L'homogénat, cytosoliques et nucléaires fractions enrichies peuvent être conservés à -20 ° C ou -80 ° C pour immunoblot après.

5. Immunoblotting semi-quantitative de protéines Synapto nucléaires

1. Décongeler les échantillons et les faire bouillir pendant 5 min à 95 ° C.
2. Prenez 5 pl de chaque fraction et déterminer la concentration en protéine par amido essai noir ou le test BCA.
3. Veuillez quantité égale d'échantillons de protéines de l'homogénat, les fractions enrichies cytoplasmiques et nucléaires sur SDS-PAGE. Les échantillons de contrôle et des tranches LTP doivent être placés sur le même gel pour une comparaison directe.
4. Effectuer une procédure ouest-buvard standard (transfert humide est recommandé).
5. Sonder les membranes avec til anticorps de choix. Par la suite les mêmes blots (ou mêmes échantillons exécuter en parallèle) peuvent être sondés avec un marqueur cytoplasmique - enolase2 neurone spécifique (NSE2) et marqueur nucléaire - NeuN et un anticorps ß-actine comme contrôle de charge.

Analyse 6. données

1. L'efficacité de l'induction de LTP peut être analysé par un logiciel Clampfit. La pente moyenne des enregistrements de base a été comparée avec les pentes après tétanisation utilisant deux ANOVA, p <0,05 a été considérée significativement différente. Les valeurs de pente fEPSP ont été représentés dans les schémas sous forme de moyenne ± SEM
2. Pour la quantification des immuno-empreintes, numériser le film autoradiographique et analyser la densité intégrée des bandes de protéines par ImageJ ou bandes de fluorescence d'un système Licor. Les valeurs de bandes immunoréactives devraient être normalisées pour le chargement et le buvard contrôle. Pour la comparaison des groupes témoins et LTP un nonparametrical Mann-Whitney U-test pourrait être utilisé.

Tableau 1: Tampons.

Nous avons précédemment montré que la protéine messager de synapto-Jacob nucléaire s'accumule dans le noyau suivant l'induction de la LTP mais pas ^une LTD. De plus, la translocation de Jacob après stimulation synaptique nécessite l'activation de MAPK ERK1 / 2 et la phosphorylation de Ser180 à Jacob (figure 1). Phosphorylée Jacob translocation vers le noyau d'une manière importin-dépendante et la forme phosphorylée peut être conservé pendant de longues périodes de temps par l'association avec le filament intermédiaire αinternexin ¹⁵ (Figure 1). L'état de phospho-Jacob est importante pour l'expression de gènes dépendants de l'activité et de la survie cellulaire. Fait intéressant, l'activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques entraîne également Jacob dans le noyau, mais dans ce cas, Jacob n'est pas phosphorylée à Ser180 et son accumulation nucléaire induit CREB 'arrêt' ^5,10. Les résultats décrits ci-dessus ont été obtenus par Protocols établies dans notre étude récente (voir Karpova et al. ¹⁰ pour une description détaillée du modèle).

Pour prouver que Jacob translocation dans le noyau après l'induction de la LTP, nous avons provoqué et mesuré l'induction de Schaffer garantie fEPSP potentialisation des tranches d'hippocampe aigus et ensuite isolé noyaux neuronaux de neurones CA1 (figures 2 et 3). Nous avons comparé les deux points de temps différents après l'application de la stimulation à haute fréquence (2 min et 30 min) et enregistré l'induction de la LTP pour chaque tranche qui a été ensuite traité pour l'isolement nucléaire et Western blot (figures 2 et 3). Enrichissement du marqueur neuronal NeuN nucléaire peut être vu dans la fraction enrichie nucléaire préparé à partir de la région CA1 disséqué, tandis que le marqueur cytosolique neurone enolase2 spécifique (NSE) est principalement présente dans la fraction de surnageant obtenu après centrifugation de c lyséesaunes (figure 4A). La spécificité de l'anticorps PS180 Jacob a été caractérisée précédemment (pour plus de détails voir Karpova et al. ^10). niveaux PS180 Jacob restés inchangés dans le total des homogénats de protéines de CA1 et dans le nucléaire fraction enrichie en 2 min après tétanisation (figure 4B), mais nous avons trouvé une augmentation significative de la pJacobS 180 immunoréactivité 30 min après l'induction de la LTP (figure 4C), ce qui confirme que Jacob translocation vers le noyau, dans ce modèle de plasticité cellulaire est phosphorylée à Ser180.

Figure 1: Jacob phosphorylée au S180 code l'origine synaptique des signaux de récepteurs NMDA. Stimulation tétanique de l'hippocampe Schaffer fibres collatérales des résultats de l'activation des récepteurs NMDA synaptiques et l'activation subséquente de MAPKERK1 / 2 cascade de signalisation. Activé ERK1 / 2 et se lie à la phosphorylation de la serine 180 Jacob et Jacob-ERK1 complexe / 2 translocation vers le noyau, ce qui est en corrélation avec l'activité accrue de la protéine CREB et l'activation de la plasticité liée expression génique.

Figure 2: Matériel et outils utilisés pour la LTP induction et disséquer la région CA1 de tranches d'hippocampe. A) Vibratome utilisé pour la préparation de coupes d'hippocampe de courte durée (1 - Vibratome) B1-2) électrophysiologie et la configuration d'imagerie (2 - Microscope; 3 - Micromanipulateur et système de perfusion; 4 - électrode Recoder; 5 - électrode de stimulation; 6 - L'eau un objectif de ; 7 - Tranche titulaire d'une tranche de l'hippocampe) C) L'équipement utilisé pour la dissection de la région CA1 de tranches d'hippocampe (8 Stereomicroscope; 9 - L'insuline seringue avec des aiguilles; 10 - Les petits ciseaux chirurgicaux; 11 - Scalpel; 12 - plastique pipette Pasteur; 13 - spatule mince; 14-100 mm boîte de culture en plastique rempli d'eau glacée, et 40 mm boîte de culture de plastique utilisé pour la dissection des tranches.

Figure 3 de bande dessinée décrivant la procédure expérimentale. Chiffres indiquent étapes du protocole. 2,1-2,8) Une tranche de l'hippocampe aiguë dans la chambre submergée avec des électrodes de verre placés dans le stratum radiatum de potentialisation de Schaffer garantie-CA1 synapses. L'encart représente les traces analogiques échantillon de fEPSP, la barre horizontale indique 5 ms et la barre verticale indique 0,5 mV. 3.3) Les tranches ont été collectées en tubes de 1,5 ml aprèsLTP enregistrement et congelé instantanément. 4.3) La dissection de la région CA1 de l'hippocampe adulte tranches de rat. 4.4-4.5) régions CA1 homogénéisés dans un tampon de lyse hypotonique, qui provoque un gonflement osmotique des cellules et la libération des noyaux. 4.8) La centrifugation des lysats à 11 000 rpm pendant 1 min. 4.10) Collection des fractions cytoplasmiques et nucléaires enrichies pour immunoblot. 5.3) Chargement de fractions cytoplasmiques et nucléaires enrichies sur SDS-PAGE et après ouest-blot standard.

Figure 4 L'induction de LTP CA1 conduit à l'accumulation de pJacS180 dans le noyau. A) Immunoblot pour homogénat cytosolique et nucléaire de fractions enrichies CA1 lysat sondé avec cytosolique et nucléaire marqueurs. B) Analyse par immunotransfert de niveau pJac-S180 homogénat à 2 min et 30 min après l'induction de tétanisation. C) d'analyse immunoblot de niveau pJacS180 dans le nucléaire fraction enrichie en 2 min et min après tétanisation. Ces résultats font partie du graphique de quantification publié dans Karpova et al ^10. Ces immunoblots représentatives ne sont pas inclus dans la publication originale.

Les étapes décrites dans le protocole ci-dessus fournissent des conseils comment préparer l'hippocampe aiguë tranches de rats, jeunes ou adultes, induire et enregistrer LTP, disséquer rapidement zone stimulée de tranche, et préparer fraction enrichie nucléaire pour l'étude de la dynamique des protéines dépendantes de l'activité. Cette approche découle de la combinaison de plusieurs méthodes utilisées indépendamment l'une de l'autre. Nous avons optimisé un flux de travail et de fournir suffisamment de détails pour le débutant de mettre en place leurs propres expériences pour étudier la redistribution subcellulaire des protéines lors de l'induction de la LTP. A titre d'exemple, nous démontrons que la forme tardive de la LTP induit l'accumulation nucléaire de S180 phosphorylée Jacob. Pour faire la distinction entre la phosphorylation d'une piscine nucléaire pré-existante d'une protéine donnée et la translocation de sa forme phosphorylée après l'activité synaptique, cette approche peut être combiné avec le contrôle de niveau total de protéine d'intérêt dans la fraction enrichie nucléaire. Par ailleurs, testiéchantillons ng sur différents points de temps après LTP induction pourraient être très utiles pour l'étude des cours de temps de la protéine d'activation / inactivation ou chiffre d'affaires nucléaires.

Lors de la préparation de fractions nucléaire enrichi à partir de tranches stimulées il ya plusieurs questions méthodologiques qui doivent être abordées. Tout d'abord, pour augmenter le nombre de neurones stimulées dans la région CA1 et la quantité de matériau pour immunobuvardage, on applique de 5 uM inhibiteur des récepteurs GABAA biccuculine pendant tétanisation. Biccuculine a été montré pour améliorer des potentiels post-synaptiques excitateurs ^3.

Deuxièmement, la préservation des tranches après l'induction de la LTP par congélation rapide est une étape cruciale pour les expériences réussies parce manutention de tranches pourrait induire différents types d'activités en corrélation directe avec les changements dans les modifications de protéines. Pour raccourcir la procédure autant que possible, nous utilisons une barre de métal placé sur de la glace sèche. Tranches peuvent être transférés dans une goutte d'ACSF l'utilisation de plastique d'une pipette Pasteur et congeler dans un très petit nombre deuxième lorsqu'il est placé sur le métal préalablement refroidi.

La troisième étape critique est l'enrichissement des noyaux dans des lysats de CA1. Nous vous recommandons de suivre le gonflement cellulaire sous le microscope et de trouver le point de temps la plus optimale. Parfois, lorsque l'homogénéisation de tissu n'a pas été effectuée correctement, les débris de cellule reste dans les échantillons. Puis le culot nucléaire peut être remis en suspension dans du tampon de lyse à nouveau, lavé pendant quelques minutes, puis centrifugé pour obtenir une fraction pure nucléaire.

Globalement, ce protocole peut aider à l'explorateur le rôle des différentes protéines messagères synapto nucléaire dans la plasticité synaptique. La même procédure peut être appliquée non seulement à une stimulation induite LTP haute fréquence, mais toutes les autres formes de plasticité synaptique comme LTD, modèles de plasticité à court terme thêta-burst LTP, et d'autres.

The authors have nothing to disclose.

This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.