Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde

Une méthode pour rapidement et complètement éliminer les composants cellulaires à partir d'un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde est décrite. Cette méthode permet d'obtenir un site spécifique de la matrice extracellulaire cardiaque échafaudage qui a le potentiel pour être utilisé dans de multiples applications cliniques.

Perfusion basée sur décellularisation organe entier a récemment suscité un intérêt dans le domaine du génie tissulaire comme un moyen de créer des sites spécifiques échafaudages de la matrice extracellulaire, bien que largement en préservant l'architecture d'origine de l'échafaud. À ce jour, cette approche a été utilisée dans une variété de systèmes d'organes, y compris le cœur, les poumons, le foie et ^1-5. Décellularisation méthodes précédentes pour tissus sans un réseau facilement accessible vasculaire ont invoqué l'exposition prolongée des tissus à des solutions de détergents, acides ou les traitements enzymatiques comme un moyen d'éliminer les composants cellulaires et nucléaires de l'environnement extracellulaire ^6-8. Cependant, l'efficacité de ces méthodes charnière sur la capacité des solutions à imprégner le tissu par diffusion. En revanche, la perfusion des organes à travers le système vasculaire naturel pour effet de réduire la distance de diffusion et de transport facilité de decellularizatides agents dans le tissu et les composants cellulaires sur le tissu. Nous décrivons ici une méthode pour bien decellularize un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde coronaire. Le protocole donné entièrement décellularisé cardiaque matrice extracellulaire (ECM-c) d'échafaudage avec la structure tridimensionnelle du coeur intact. Notre procédé utilisé une série d'enzymes, les détergents, les acides et les produits de rinçage couplé avec hypertoniques et hypotoniques pour aider à la lyse et l'élimination des cellules. Le protocole utilisé une solution de Trypsine pour détacher les cellules de la matrice, suivie par des solutions de Triton X-100 désoxycholate de sodium et d'aider à l'élimination de la matière cellulaire. Le protocole décrit utilise également des vitesses de perfusion de plus de 2 L / min pour des périodes de temps prolongées. La vitesse d'écoulement élevée, associée à des changements souhaités solution transport d'agents dans le tissu sans contamination des débris cellulaires et assurer un rinçage efficace du tissu. La méthode décrite enlevé toutes les matières nucléaires de native porcine tissu cardiaque, la création d'un site spécifique cardiaque ECM échafaudage qui peut être utilisé pour une variété d'applications.

1. Préparation des tissus et Experiment Setup

1. Organe porcin récolte immédiatement après l'euthanasie d'une installation abattoir ou de la recherche et de rincer l'excès de sang. Coupez le cœur de l'excès de graisse et de tissus, en gardant les oreillettes et l'aorte intacte. Coupez le gras de séparer l'artère pulmonaire à l'aorte. S'il ya des coupures dans le tissu, jeter de façon appropriée.
2. Enveloppez chaque coeur individuellement dans du papier congélateur et stocker tous les tissus dans un congélateur à -80 ° C pendant au moins 24 h à garantir une congélation complète.
3. Lorsque vous êtes prêt à l'emploi (généralement moins de 3 mois), le dégel un cœur intact de porc congelé dans de l'eau de type 1 nuit immergé dans un bêcher de 4 L à 4 ° C.
4. Après le cœur est complètement dégelé, caresser le cœur sec, peser le cœur, et noter le poids. Le cœur d'un cochon poids de marché devrait peser environ 375-450 g.
5. Connectez taille 18 tube Masterflex à l'¼ "fin d'un réducteur de fer barbelé. Insérez le réducteur de fer barbelé ettube intérieur de l'aorte. Placer les pinces de serrage 2 ou attaches sécurisées autour de l'aorte, juste en dessous du tronc brachio-céphalique. Le réducteur et la tubulure doit rester au-dessus de la valve aortique, de sorte que les artères coronaires peut être perfusé (figure 1).
6. Utilisez une seringue de 30 ou 60 ml pour remplir le tube avec de l'eau de type I. Insérer le tube dans la cartouche d'une pompe à galet Masterflex en son milieu approximatif. Plonger l'extrémité d'entrée du tube dans le fond d'un bêcher rempli 4 L à 2,5 L d'eau et fixer le tube.
7. Placez le cœur dans le bécher rempli d'eau, et amorcer la pompe pour éliminer les bulles d'air. Si des bulles sont observées en provenance de l'aorte où le tube est inséré, l'aorte peut être nécessaire de repositionner ou fixé avec des liens supplémentaires. Un joint étanche est important de maintenir une pression adéquate pendant le processus de décellularisation (Figure 2).
8. Placer le bécher contenant 4 L 3 L de 0,2% NaN% Trypsin/0.05 EDTA/0.05%3 solution sur plaque d'agitation et le réchauffer à 37 ° C dans la préparation du processus décellularisation.

2. Se rince le tissu

1. Régler la pompe à un débit de 400 ml / min, en veillant à ce que le diamètre de la conduite correcte est sélectionnée. Rincer le cœur avec Eau de type I pour 15-25 min. Comme la pompe est démarrée, le cœur doit gonfler et écouler le sang des ventricules. Une solution fraîche doit être remplacé tous les 5-10 minutes, ou selon les besoins en fonction de la quantité de sang prélevée à partir du cœur. Si le sang n'est pas épanché du cœur, ajustez le tuyau et pinces si nécessaire.
2. Arrêter la pompe et de transférer le cœur à un bêcher séparé rempli de solution saline tamponnée au phosphate 2X (PBS). Après que le tuyau est immergé dans la solution, la pompe démarre et augmenter le débit de 700 ml / min. Le cœur doit rester dans la solution pendant 15 min, en changeant la solution toutes les 5 min. Une variation de la pompe solution nécessite d'être arrêté temporairement tandis que les tissus et le tube est déplacéDans le bécher de nouveau.
3. Transfert au cœur de type I eau pendant 10 min et augmenter le débit à 750 ml / min.

3. Perfusion décellularisation et Solution

1. Transférer le coeur dans le bécher contenant 0,2% Trypsin/0.05% _EDTA/0.05% de NaN3 à 37 ° C. Augmenter la vitesse de la pompe à 1200 ml / min et démarrer la pompe. Utiliser un barreau d'agitation placé au fond du bécher pour faire circuler la solution dans le bécher. Le cœur doit rester dans le 0,2% Trypsin/0.05% _EDTA/0.05% de NaN3 solution à 37 ° C pour un total de trois heures. Après 1 h, augmenter la vitesse de la pompe à 1500 ml / min. Après une heure supplémentaire, augmenter la vitesse de la pompe à 1.800 ml / min. Le tissu est soumis à une lente vitesse de perfusion accrue à l'état du tissu et d'éviter la rupture des vaisseaux. Le cœur se gonfle et près du double de la taille lors de cette étape du protocole. Le tissu perd sa couleur naturelle, progressant de l'oreillette vers le sommet tout au long èmee protocole (Figure 3).
2. Après chaque perfusion de solution, une étape de rinçage est effectuée deux pour éliminer les débris cellulaires, résidus chimiques, et la lyse des cellules de l'aide. Chaque rinçage comprend un rinçage à 10 min de type I d'eau suivie d'un rinçage avec 10 min une solution de PBS 2X à température ambiante. Chaque lavage consiste en l'élimination de la solution du bécher originale, l'ajout des solutions de rinçage et de circulation du liquide de perfusion dans le bécher contenant le coeur immergé. Après l'0,2% Trypsin/0.05% _EDTA/0.05% de NaN3 solution, l'eau perfuse à 1900 ml / min, puis perfuser 2X PBS à 1950 ml / min.
3. Transférer le cœur à une solution de 3% de Triton X-100/0.05% _EDTA/0.05% de NaN3 à la température ambiante. Augmenter la vitesse de la pompe à 2.000 ml / min et la solution perfuse pendant une heure. Enlever la solution du bécher et la remplacer par une nouvelle solution, augmenter la vitesse de la pompe à 2100 ml / min, et perfuser la solution fraîche pendant une heure supplémentaire et demi, ce qui porte la durée totale en3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ à 2,5 heures.
4. Rincer le tissu à eau de type I à 2150 ml / min et 2X PBS au 2180 ml / min pendant 10 min à chaque fois.
5. Transférer le cœur à une solution de désoxycholate de sodium à 4% à la température ambiante. Augmenter la vitesse de la pompe à 2200 ml / min et la solution perfuse pendant 3 heures.
6. Rincer le tissu à eau de type I à X et 2X PBS à 2200 ml / min pendant 15 min à chaque fois, en changeant les solutions après 5-10 min pour chaque solution. Les étapes décrites perfusion peut être réparti sur plusieurs jours en effectuant l'étape consistant à rincer deux fois et stocker le coeur avec un tube attaché pendant une nuit à 4 ° C et immergé dans l'eau de type I.
7. Le lendemain, effectuer un rinçage à 5 min à eau de type I à 750 ml / min, suivi d'un rinçage 5 min dans du PBS 1X à 1500 ml / min. Le protocole peut alors être repris à la vitesse d'écoulement décrits dans la solution adéquate.

4. Désinfection et traitement final

1. Transfert au cœur d'un PERAC 0,1%acide étique / solution éthanolique 4% et perfuser une solution de 1,5 heure à 2.200 ml / min.
2. Les derniers rinçages pour les tissus sont tous effectués à 2.200 ml / min. Perfuser le tissu avec du PBS 1X pendant 15 min, suivie de deux lavages de 5 min dans de l'eau de type I. Cette série de rinçages est répété une fois de plus afin de compléter la procédure de perfusion solution.
3. Mettez la pompe hors tension et retirez le cœur de la solution de vider le coeur. Coupez les attaches de l'aorte, enlever tous les tuyaux, et placez le coeur dans un bécher vide égoutter pendant 1 heure. L'excès de liquide doivent être vidangés périodiquement. Posez le coeur sur un tampon absorbant afin de décharger complètement le cœur (figure 4).
4. Après plus de l'eau est éliminée, enregistrer le poids de la matrice extracellulaire cardiaque (C-ECM). Le cœur peut s'attendre à perdre environ 20-25% de son poids initial au cours du processus décellularisation.
5. Disséquer les ventricules droit et gauche, ainsi que le septum ventriculaire de l'ADN quantificatiet le traitement histologique dans le but de confirmer décellularisation complet du tissu (figure 5).
6. Congeler le C-ECM à -80 ° C pendant au moins 2 heures avant la lyophilisation.

L'effet de décellularisation sur les cœurs de porc entières varie naturellement en raison de différences dans la taille, la pression, et la disposition des navires. Par conséquent, la composition exacte des échafaudages dérivés de la matrice extracellulaire ne sera pas la même chose de cœur à cœur. L'achèvement du protocole décrit donnera un cœur qui apparaît en blanc ou translucide, indiquant la perte de matériel cellulaire. Cependant, il est largement admis qu'un tissu peut être considéré comme «décellularisé" basée sur la combinaison de quelques paramètres plus quantitatifs ^8. Un protocole de décellularisation fructueux va produire une matrice de moins de 50 ng de l'ADN double brin par mg de tissu (figure 6). Afin d'éviter une réponse immunitaire de l'hôte lors de l'implantation de la matrice, l'ADN restant doit également contenir moins de 200 paires de bases (Figure 7). Pour confirmer ces résultats, la coloration hématoxyline et à l'éosine devrait révéler l'absence d'armes nucléairescoloration des sections représentatives des ventricules et du septum ventriculaire (figure 8). Trichrome de Masson confirme en outre la perte de paquets du muscle cardiaque et le maintien de réseaux de collagène (figure 9).

Figure 1. L'extrémité cannelée de la tubulure est insérée dans l'aorte du coeur natif. Le tube doit être fixé avec des colliers ou des liens zip-dessus de la valve aortique pour assurer la perfusion dans les artères coronaires.

Figure 2. Le coeur est immergé dans l'eau dans un bécher de 4 litres et de bulles d'air doit être présente dans le tube. Si des bulles sont observées sortant de l'aorte près de la tuyauterie, des liens additionnels doivent être utilisés pour fixer le tube à t il aorte, afin de maintenir une pression suffisante dans le tissu.

Figure 3. Comme les solutions sont perfusés à travers les artères coronaires, le cœur va perdre sa couleur d'origine, progresse des oreillettes à la pointe du coeur et localisée autour des artères coronaires.

Figure 4. Après l'achèvement de la désinfection et de rinçage étapes du protocole, le tube est retiré et le cœur est placé sur un tampon absorbant pour permettre à l'eau en excès de s'écouler hors du coeur. Cela garantit une mesure précise lors de la pesée du tissu et permet également le tissu pour se détendre avant de sectionnement.

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Figure 5. Le ventricule gauche (VG), le ventricule droit (VD) et d'un septum ventriculaire sont tous retirés du coeur décellularisé pour le traitement, la congélation et la lyophilisation histologique et quantification de l'ADN.

Figure 6. L'analyse quantitative de la teneur en ADN en utilisant un test vert Pico. Les ventricules du cœur CECM montrent une diminution significative du contenu en ADN par rapport aux ventricules indigènes. Les valeurs observées ADN de ce protocole sont observées au niveau ou au-dessous de 50 ng / mg de tissus standard pour décellularisé.

La figure 7. Taille des fragments d'ADN, tel que déterminé par ethidium bromure gel, a montré peu d'ADN résiduel dans les ventricules décellularisée par rapport à une matrice de vessie urinaire (UBM) standard.

Figure 8. Hématoxyline et coloration à l'éosine a montré une élimination complète des matières nucléaires à partir des ventricules après la fin du protocole décellularisation.

Figure 9. Coloration trichrome de Masson de A) et B natif) décellularisé ventricule.

La présente étude décrit la méthodologie pour décellularisation cohérente et efficace d'un coeur de porc. Le protocole a été une modification à un rapport déjà publié ^1, et comprenait une exposition plus longue à l'écoulement et de la pression accrue, ce qui a donné des résultats plus reproductibles. Le tissu résultant décellularisé satisfait à tous les critères publiés pour décellularisation réussie de tissu ^2. Changements fréquents de solution ont été réalisées afin de limiter la réintroduction du matériau cellulaire dans le tissu, et la durée d'exposition à chaque agent de décellularisation a été réduit au minimum afin de réduire les effets néfastes sur l'ECM. Pendant les premiers stades du protocole, le débit de perfusion a été augmentée progressivement à l'état du tissu et permettre des débits plus élevés au cours des étapes ultérieures du protocole. Sans conditionnement des tissus dans les premiers stades, la vascularisation du coeur peuvent se rompre, ce qui rend perfusion du coeur impossible. Le protocol a été utilisé en raison de son efficacité, et aucune réclamation n'a été faite à sa supériorité sur les autres protocoles. La composition exacte des agents décellularisation et les taux de perfusion peut éventuellement être modifié pour produire un protocole avec de meilleures caractéristiques mécaniques ou biologiques, mais les principes généraux de la livraison des agents du cœur sont applicables.

La préservation de l'indigène structure tridimensionnelle du cœur a été attribué à plusieurs procédures effectuées à travers le protocole décellularisation. Tout d'abord, le tissu a été découpé et congelé à l'arrivée. Gel de promouvoir la lyse des cellules et est important pour le pré-conditionnement des tissus pour les cycles de perfusion. Le tissu a été soigneusement inspectées pour détecter les coupures et 2 cm de l'aorte intacte intacte supérieur à la valve aortique. Si un péricarde ou épicarde a été coupé, l'organe a été écartée parce que la perfusion n'a pas atteint les régions en aval du cœur, et le cœur n'a pas été entièrement décellularisé.Ensuite, le tissu a été complètement décongelée dans le type I eau avant utilisation. L'eau a permis au tissu de se détendre comme il décongelés et a également contribué à l'élimination de caillots sanguins résiduels dans le cœur. Enfin, comme le tube a été inséré, on a pris soin de s'assurer que la valve aortique est restée intacte afin qu'elle forme un joint étanche à l'eau autour du tube, de sorte qu'une pression appropriée a été maintenue et que la solution entré dans les artères coronaires.

Après chaque protocole décellularisation a été achevée, une série de mesures de contrôle de qualité ont été réalisés afin d'assurer une élimination complète du matériau cellulaire. La présente étude a vérifié que le protocole de coloration histologique pour éliminer les noyaux des cellules, a montré que moins de 50 ng d'ADN était présent par mg de poids sec du tissu, et que tout l'ADN est inférieure à 200 pb de taille ^6. Méthodes déjà publiées pour décellularisation cardiaque a montré des niveaux similaires de décellularisation de coloration de l'ADN et la quantification^2,5,9,10. Décellularisation complète a été réalisée dans ces études utilisant des traitements similaires des enzymes et des détergents. Toutefois, dans la présente étude, la durée d'exposition à chaque produit chimique a été augmenté, il ya eu des changements solution plus, et les débits ont augmenté. Le présent protocole a également augmenté la longueur de rinçages chimiques, pouvant conduire à l'élimination plus efficace des résidus de produits chimiques à partir de la matrice extracellulaire.

Recellularization des coeurs de rats avec décellularisé cardiaques cellules spécifiques a donné des résultats prometteurs in vitro ^2,5. Toute décellularisation la perfusion des organes autorisés pour l'entretien de la vascularisation d'origine, ce qui est essentiel dans recellularization du tissu. Les facteurs de croissance sont inhérentes, protéines de la matrice et de l'architecture fibreuse tridimensionnelle a également favorisé l'attachement cellulaire appropriée, de migration et de signalisation pour reconstituer le tissu myocardique contractile. Porcine cardiaque extracellulaireLAR matrice sera plus difficile à recellularize raison de la taille de l'échafaudage et le nombre de cellules nécessaires pour la communication des cellules et le transport des nutriments. Cependant, les correctifs découpées dans la matrice cardiaque peut être utile pour des applications in vivo. Plusieurs études ont montré l'intérêt potentiel de l'utilisation d'une matrice spécifique au site pour la reconstruction des tissus endommagés dans des modèles animaux ^11-13. Ainsi, une matrice extracellulaire échafaudage dérivé du tissu cardiaque est souhaitable pour des applications de reconstruction du myocarde. L'architecture inhérente du tissu cardiaque peut présenter des avantages sur un échafaud ECM dérivé d'un autre organe ou un biomatériau artificiel. Un site spécifique échafaudage peut soutenir une infiltration de cellules d'accueil et promouvoir une réponse constructive remodelage, par opposition à la formation de tissu cicatriciel. À ce jour, patchs cardiaques ECM ont été étudiés in vivo de reconstruire un défaut créé dans le myocarde paroi ^14. Future étudiantsdies seront réalisées in vitro pour examiner la capacité de l'échafaudage pour soutenir les cellules cardiaques ensemencées et cultivées sur la matrice. Les méthodes décrites ici peuvent également s'appliquer à décellularisation des cœurs humains.

En conclusion, décellularisation coeur de porc est possible et les méthodes sont simples. Poursuite des investigations sur ce produit permettra de mieux comprendre son potentiel pour une utilisation clinique.

Dr. Gilbert a siégé au conseil consultatif scientifique ACell, Inc tandis que l'étude a été fait, et est récemment devenu le vice-président de la recherche et du développement. ACell, Inc vend matrice de la vessie et n'a aucun intérêt commercial dans la présente étude.

Les auteurs tiennent à remercier Brogan Invité, Michelle Weaver, et Kristen Lippert. Le financement de cette étude a été fourni par des subventions du NIH R03EB009237, ainsi que les subventions de formation NIH T32EB001026-06 de l'Institut national d'imagerie biomédicale et de la bioingénierie et T32HL076124-05.