La investigación en mi laboratorio se centra en comprender los mecanismos subyacentes que promueven la fatiga muscular en pacientes con cáncer de mama. Específicamente, queremos entender la comunicación entre un tumor localizado en el tejido mamario con el músculo esquelético periférico, y luego las respuestas moleculares dentro de ese músculo que conducen a la fatiga. El desarrollo de modelos de cultivo celular en 3D está permitiendo estudios de alto rendimiento en los que las respuestas funcionales, como la fatiga muscular, pueden estudiarse en condiciones controladas.
Los experimentos de cultivo celular funcional se pueden llevar a cabo en paralelo y requieren menos tiempo que los modelos animales equivalentes, lo que facilita el descubrimiento y la innovación rápidos. La evaluación de fenotipos funcionales relevantes utilizando modelos tradicionales de xenoinjertos derivados del paciente requiere mucho tiempo y recursos. Este protocolo facilita la inyección simultánea de PDX en ratones, lo que permite a los investigadores estudiar las respuestas sistémicas a los tumores humanos utilizando experimentos con animales bien potenciados.
Este protocolo permite la inyección ortotópica de células tumorales de mama derivadas de pacientes a una escala mejorada con respecto a los métodos existentes, lo que facilita la inyección rápida de hasta varias docenas de ratones por día por un solo investigador. Además, la disociación del tumor genera una suspensión celular homogénea que distribuye uniformemente los tipos de células entre los animales. Los datos de mi laboratorio han identificado respuestas moleculares musculares similares al cáncer de mama en pacientes con cáncer humano, ratón PDX y ratón PDX.
Por lo tanto, queremos utilizar este modelo preclínico de ratón para seleccionar fármacos candidatos e identificar terapias con el potencial de mitigar la fatiga en pacientes con cáncer de mama. Para comenzar, descongele las enzimas H, R y A del kit de disociación de tumores humanos. Agregue 200 microlitros de enzima H, 100 microlitros de enzima R y 25 microlitros de enzima A en un tubo estéril C. Agregue 4,7 mililitros de medio estéril RPMI 1640 al tubo C para ajustar el volumen final a aproximadamente cinco mililitros.
A continuación, transfiera los fragmentos tumorales descongelados y el medio de congelación que los acompaña a la mitad de una placa de cultivo estéril de 100 milímetros. Con pinzas estériles, transfiera los fragmentos tumorales a un microtubo estéril de cinco mililitros y lávelos con uno a tres mililitros de PBS estéril. Con pinzas estériles, transfiera los fragmentos desinfectados a un nuevo microtubo de cinco mililitros.
Después de un segundo lavado con PBS estéril, transfiera los fragmentos a la mitad seca de la placa de cultivo de 100 milímetros. Con dos hojas estériles de bisturí número 10, pique bien el tejido tumoral. Transfiera los fragmentos tumorales picados a una cuchilla y deposítelos en el tubo C que contiene la solución enzimática preparada.
Invierta el tubo C varias veces para asegurar una distribución uniforme de los fragmentos tumorales dentro de la solución enzimática. Ahora coloque el tubo C en el disociador mecánico e invierta el tubo para asegurarse de que todo el contenido esté sumergido en el medio. Seleccione el programa 37CHTDK3 en la interfaz de la pantalla táctil.
Una vez finalizado el programa de disociación, inspeccione el contenido del tubo. Una vez que se logre la disociación adecuada, centrifugue el tubo C a 200 G durante cinco a ocho minutos a cuatro grados Celsius. Utilizando aspiración al vacío o una pipeta, retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en RPMI 1640 a un volumen equivalente a la mitad del volumen de inyección final deseado.
En un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de dos mililitros, combine la cantidad deseada de suspensión celular diluida en RPMI con un volumen igual de Matrigel. Mezcle suavemente la suspensión mediante pipeteo repetido para garantizar la homogeneidad. Para empezar, disociar los tumores de mama humanos en una suspensión unicelular.
Luego, usando una jeringa de un mililitro sin aguja adjunta, aspire suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para garantizar la homogeneidad. Coloque una aguja de calibre 26 en la jeringa y extraiga el volumen de inyección deseado. A continuación, golpee o agite suavemente la jeringa para eliminar las burbujas de aire.
Aplique una capa delgada de crema depilatoria en el sitio de inyección objetivo en el mouse. Después de limpiar el área de inyección, agarre la piel dorsal firmemente por la nuca y la espalda para sujetar firmemente al ratón y colóquelo en posición supina. Inserte la aguja en un ángulo de 45 grados apuntando hacia la cadera aproximadamente de 0,5 a un centímetro caudal a la almohadilla de grasa, ajustando la longitud de la aguja.
Avance la aguja en la almohadilla de grasa y, de manera controlada, inyecte el volumen deseado de suspensión celular. Después de la inyección, gire la aguja 180 grados y mantenga la posición brevemente antes de retirarla lentamente para minimizar la pérdida de células del lugar de la inyección.
