Nuestra investigación se centra en la dinámica de los ARN activos catalíticos y en cómo cambia esta dinámica en diferentes condiciones ambientales. Utilizamos FRET de una sola molécula para estudiar la influencia de factores como las líneas medias monovalentes y divalentes, las proteínas chaperonas y los agentes de aglomeración en la dinámica del ARN. La incorporación precisa de fluoróforos donantes y aceptores sin alterar la estructura y la función del ARN es un desafío.
Además, es difícil rastrear el plegamiento de un ARN dinámico grande. Sin embargo, el protocolo de marcaje y encapsulación establecido nos permite monitorizar la dinámica de plegamiento del ARN funcional a lo largo del tiempo. Nuestro protocolo aborda el reto de observar grandes ARN catalíticamente activos en tiempo real y en condiciones neofisiológicas.
Al marcar y encapsular covalentemente el ARN y las vesículas, que luego se inmovilizan en la superficie, podemos monitorear la función del ARN con TIRF de molécula única. Nos centramos en el marcaje covalente FRET de ARN catalíticos largos y, en particular, de intrones del grupo II. Esto supone un reto debido a su complejidad estructural.
Cuando se encapsula en vesículas, podemos mantener el ARN dentro del campo evanescente para la microscopía TIRF y, sin embargo, el ARN puede flotar libremente. De esta manera, smFRET puede revelar el comportamiento dinámico del ARN sin obstáculos. Continuaremos tratando de comprender cómo funciona realmente la naturaleza, centrándonos en la relación estructura-función y la dinámica de los ribosomas, ribointerruptores y otros ARN reguladores utilizando un enfoque multitécnico.
Por lo tanto, avanzar hacia investigaciones en condiciones fisiológicas y celulares será un énfasis importante de nuestro trabajo en el futuro. Para comenzar, alícuota el ARN de interés, que tenga de 50 a 75 microgramos de ARN por tubo en 55 microlitros de agua bidestilada, luego agregue 45 microlitros de la mezcla de acetato de sodio EDC / NHS pH 6 al ARN. Incubar la mezcla durante cuatro horas a 25 grados centígrados mientras se agita a 500 RPM.
Después de la incubación, vuelva a suspender el pellet de ARN activado en 95 microlitros de tampón MOPS de 100 milimolares pH 7,5. Luego agregue cinco microlitros de cianina-3 sulfonada de dos milimolares al ARN activado e incube a 25 grados Celsius durante 16 horas a 500 RPM para acoplar el fluoróforo al fosfato 5-prime activado. Al día siguiente, agregue 200 microlitros de agua bidestilada para mejorar la separación.
A continuación, purifique el ARN marcado con fosfato 5-prime mediante precipitación de etanol. Después de la purificación, vuelva a suspender el ARN marcado en 100 microlitros de tris HCl de 100 milimolares e incube durante dos horas a 25 grados centígrados. Luego, para eliminar los colorantes libres, lave el ARN marcado en agua bidestilada con filtración centrífuga.
Para el marcaje de doble extremo, alícuota el ARN marcado con 5 extremos primarios, que tiene aproximadamente de 50 a 75 microgramos de ARN por tubo en 90 microlitros de solución. Añadir cinco microlitros de tampón de acetato de sodio de un molar pH 5,5. A continuación, añada cuatro microlitros de solución madre de metaperiodato de sodio de 500 milimolares recién preparada.
Para el etiquetado único de 3 cebadores, agregue ocho microlitros de solución madre de metaperiodato. Después de incubar las soluciones en la oscuridad durante dos horas, pipetee 30 microlitros de glicerol al 50% para detener la reacción. Después de 30 minutos de incubación, agregue 400 microlitros de mezcla de precipitación de acetato de sodio y etanol helada.
Vuelva a suspender el pellet de ARN oxidado en 95 microlitros de tampón de acetato de sodio de 50 milimolares pH seis. Purifique el ARN marcado con doble extremo mediante precipitación de etanol y filtración centrífuga, como se demostró anteriormente. Eluir el ARN purificado en agua bidestilada.
Compare visualmente los colores del sobrenadante y de los gránulos obtenidos después de cada paso. Calcule las concentraciones de ARN y colorante conjugado en un espectrofotómetro UV-visible. La electroforesis en gel fluorescente confirmó el éxito del marcaje simple y doble del ARN, como lo demuestra la comigración del ARN con los fluoróforos.
La eficiencia de FRET aumentó en presencia de iones metálicos, lo que indica un plegamiento del ARN, lo que condujo a una disminución en la emisión del donante y un aumento en la emisión del aceptor. Para preparar una cámara microfluídica, use un perforador de diamante para perforar cuatro orificios en los portaobjetos de cuarzo para formar dos canales. Coloque los portaobjetos de cuarzo perforados y aproximadamente el doble de cubreobjetos en un frasco de tinción Coplin de vidrio con tapa.
Sonicar los portaobjetos y cubreobjetos en agua bidestilada durante cinco minutos. A continuación, sonique el frasco en una solución de limpieza de cristalería de laboratorio al 10% durante 30 minutos a 50 grados centígrados. Después de enjuagar el frasco con agua bidestilada, sonicar en una solución de hidróxido de potasio de un molar durante 30 minutos y dejarlo en la solución durante la noche.
Después de repetidos enjuagues y sonicación con agua destilada, seque los portaobjetos y cubreobjetos utilizando un flujo de gas nitrógeno. Trate los portaobjetos y cubreobjetos secos con un limpiador de plasma de oxígeno durante 30 minutos. Coloque los portaobjetos limpios y los cubreobjetos en un frasco de tinción Coplin que contenga una solución de etanol de prueba AP al 3% de Sonicate durante un minuto y luego incube durante 30 minutos.
Enjuague los portaobjetos y los cubreobjetos tres veces cada uno con etanol absoluto y agua bidestilada, luego séquelos bajo flujo de gas nitrógeno. A continuación, prepare una caja húmeda llenando una caja de punta de pipeta vacía hasta la mitad con agua bidestilada. Coloque los portaobjetos dentro de la caja con el lado a tratar hacia arriba.
Agregue gotas de 30 microlitros de mezcla bPEG/mPEG recién preparada al centro del portaobjetos para cubrir ambos canales. Cubra la gota con un cubreobjetos limpio y cierre la caja húmeda. Incuba la caja durante la noche en la oscuridad para la pegilación.
Al día siguiente, enjuague los portaobjetos y cubreobjetos pasivados y biotinilados con PEG con agua bidestilada y observe el cambio en la hidrofobicidad de las superficies tratadas. Pega la pegatina de doble cara a la guía, asegurándote de que la pegatina cubra el área de interés. A continuación, coloque con cuidado el cubreobjetos en la parte superior del portaobjetos, alineando las superficies pegiladas para que se enfrenten entre sí.
Transfiera la cámara ensamblada a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y llene el tubo con gas nitrógeno. Para comenzar, use una aguja estéril para hacer un agujero de adentro hacia afuera en la tapa de un tubo estéril y limpio de dos mililitros. Agregue 109 microlitros de la mezcla de bPE-DMPC en el tubo.
Coloque un inserto de tabique de celda de cartón de una caja de almacenamiento de microtubos en un matraz Schlenk de 500 mililitros para que sirva como soporte de tubos. Con unas pinzas largas, coloque con cuidado los tubos que contienen la mezcla de lípidos en el soporte del tubo. Evapore el cloroformo bajo un flujo bajo de gas nitrógeno durante la noche.
Después de obtener la capa lipídica seca, selle los tubos con parafilm para cubrir los agujeros. Ensamble el extrusor con una membrana de policarbonato de 100 nanómetros y un disco de drenaje de poliéster de 10 milímetros. Equilibre la jeringa y las membranas con tampón antiparpadeo.
Después de mezclar el ARN marcado con doble extremo con tampón antiparpadeo, hidrate la torta de lípidos con la mezcla de tampón antiparpadeo de ARN a 30 grados centígrados. Agite durante cinco minutos a 1.400 RPM, seguidos de 15 minutos a 700 RPM. Centrifugar la mezcla durante dos minutos a 13.000 g y diluir el sobrenadante con 250 microlitros de tampón antiparpadeo.
Llene la jeringa con la suspensión lipídica de ARN y extruya 35 veces a 30 grados Celsius en un bloque calefactor para encapsular el ARN marcado con doble extremo en vesículas de fosfolípidos de 100 nanómetros de diámetro. Enjuague la cámara dos veces con 200 microlitros de tampón estándar 5X a temperatura ambiente. Llene la cámara con 50 microlitros de 20 microlitros por mililitro de solución de estreptavidina e incube durante cinco minutos.
A continuación, enjuague la cámara con 200 microlitros de tampón estándar y 100 microlitros de tampón antiparpadeo. Añadir 75 microlitros de suspensión de vesícula e incubar durante 10 minutos para la inmovilización del ARN encapsulado en la superficie. Después de la inmovilización, enjuague la cámara con 200 microlitros de tampón de imagen recién preparado.
Para la adquisición de datos, monte la cámara en el microscopio TIRF y adquiera datos smFRET con excitación láser alterna. Las imágenes FRET de una sola molécula mediante microscopía TIRF rastrearon moléculas de ARN individuales y detectaron cambios en tiempo real en la eficiencia de FRET. Los trazos dinámicos de una sola molécula mostraron fluctuaciones anticorrelacionadas entre las señales del donante y del aceptor, lo que indica cambios confirmatorios en el ARN.
