Nos comprometemos a estudiar el mecanismo de fusión de las membranas intracelulares. En este protocolo, nuestro objetivo es realizar la dinámica conformacional de la proteína de fusión de la membrana del retículo endoplásmico atlastina durante su ciclo de hidrólisis GTP mediante smFRET. La atlastina puede existir como monómero o dímero en el ciclo de hidrólisis GTP.
En los experimentos de una sola molécula, es difícil encontrar estrategias adecuadas de etiquetado e inmovilización de proteínas, y a continuación se presenta la dinámica conformacional de la atlastina a lo largo del ciclo de hidrólisis de GTP. En comparación con FRET a granel, smFRET puede monitorear con precisión las conformaciones de proteínas en diferentes estados de carga de nucleótidos, lo que proporciona una visión directa del comportamiento de las moléculas moduladoras. Utilizamos el smFRET para resolver completamente el ciclo de hidrólisis GTP de la atlastina durante diferentes estrategias de posición.
Creemos que nuestros hallazgos promoverán una dinámica más conformacional en el estudio de las proteínas de hidrólisis GTP y proporcionarán nuevas interpretaciones de procesos biológicos raros. Para limpiar la superficie del cubreobjetos, use pinzas para recoger ocho cubreobjetos y colóquelos en un frasco para manchar. Agregue 50 mililitros de acetona para cubrir los cubreobjetos y coloque el frasco de tinte en un limpiador ultrasónico durante 30 minutos.
Enjuague los cubreobjetos tres veces con agua destilada doble y lávelos con metanol en un limpiador ultrasónico. A continuación, agregue la solución de piraña al frasco de tinción y caliéntelo en una tetera al baño de agua a 95 grados centígrados durante dos horas. Después de enfriar el frasco a temperatura ambiente, enjuague los cubreobjetos seis veces con agua destilada doble.
Agregue la solución de metóxido de sodio en el frasco de tinción y colóquela en el limpiador ultrasónico durante 15 minutos. Después de enjuagar los cubreobjetos con agua, agregue agua destilada doble al frasco de tinción y colóquelo en el limpiador ultrasónico durante 15 minutos. Sujete los cubreobjetos en el frasco de tinción y séquelos con nitrógeno.
Transfiera los cubreobjetos secos a otro frasco para manchar y hornee el frasco en un horno de secado a 120 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, enfríe el frasco a temperatura ambiente en un desecador. Agregue 47,5 mililitros de metanol, 2,5 mililitros de ácido acético y 0,5 mililitros de trietoxisilano a un vaso de precipitados y mezcle uniformemente.
Transfiera la mezcla al frasco de tinción e incube durante 10 minutos. Enjuague los cubreobjetos tres veces con agua destilada doble en el frasco de tinción y sonique durante cinco minutos. Después de enjuagar los cubreobjetos con agua y secarlos con nitrógeno como se demuestra, coloque los cubreobjetos en una placa de Petri de 10 centímetros de diámetro.
Disuelva SVA-mPEG y SVA-mPEG-Biotina en la solución con alto contenido de sal en una proporción de 1:100. Deje caer la mezcla preparada en un cubreobjetos y cúbralo con otro cubreobjetos. Incubar los cubreobjetos con la humedad adecuada durante dos horas o toda la noche.
Después de la modificación, separe los cubreobjetos, enjuáguelos con agua desionizada y séquelos con nitrógeno. Coloque con cuidado el cubreobjetos modificado en un tubo de 50 mililitros. Después de purificar el dominio GTPasa de la proteína atlastina similar a la dinamina o ATL expresada en las células Rosetta E. coli, cambie el tampón proteico por el tampón de biotinilación proteica utilizando un filtro centrífugo de 10 kilodalton.
Para la biotinilación de proteínas, mezcle 100 microlitros de ATP de 100 milimolares, acetato de magnesio de 100 milimolares y D-biotina de 500 micromolares, 10 microlitros de biotina ligasa BirA de 100 micromolares y 50 micromolares de proteína hasta obtener un volumen final de un mililitro. Incubar la mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, elimine la D-biotina libre utilizando un filtro centrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodalton.
Incubar 20 microlitros de proteína biotinilada con 20 microlitros de estreptavidina de 15 micromolares durante 20 minutos en hielo. Detecte la eficiencia de la biotinilación de proteínas utilizando SDS-PAGE. Disuelva los fluoróforos LD555 y LD655 en dimetilsulfóxido hasta una concentración final de cinco milimolares.
Para preparar el tampón de etiquetado, mezcle 25 milimolares de HEPES, 150 milimolares de cloruro de potasio y cinco milimolares de cloruro de magnesio. Cambie el tampón de proteínas por el tampón de etiquetado utilizando un filtro centrífugo de 10 kilodalton. Para ensayos smFRET intramoleculares, mezcle ATL1cyto-TK con LD555 y LD655 en una proporción de 1:1.2:1.2 hasta un volumen final de 100 microlitros.
Incubar la mezcla durante cinco horas a cuatro grados centígrados. Para los ensayos smFRET intermoleculares, incubar ATL1cyto-K con LD555 y ATL1cyto-K biotinilado con LD655 durante cinco horas a cuatro grados Celsius. Para preparar la cámara de inmovilización de proteínas, pegue con cuidado el cubreobjetos modificado y el portaobjetos del microscopio con cinta adhesiva de doble cara personalizada.
Instale mangueras y puntas para formar una cámara microfluídica con seis canales. Para las correcciones de mapeo, agregue 10 microlitros de partículas de poliestireno al 10% en un portaobjetos de microscopio y cúbralo con un cubreobjetos. A continuación, bajo un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total, seleccione un campo de visión que contenga partículas de poliestireno y capture un vídeo en modo de campo claro.
Utilice un script personalizado para alinear la ubicación central de la misma partícula de poliestireno en los canales donante y aceptor. Guarde el archivo de mapa como un archivo TXT. Para experimentos intermoleculares smFRET, mezcle LD555 marcado con ATL1cyto-K con LD655 marcado con ATL1cyto-K-biotina en una proporción de uno a uno con una concentración final de un milimolar de GTP-gamma-S.
Incubar la mezcla en hielo durante una hora para dimerizar las proteínas. Mezcle la biotina ATL1cyto-T marcada con ATL1cyto-K marcada con LD655 en una proporción de uno a uno con un milimolar de GTP-gamma-S para los experimentos smFRET intermoleculares ATL1cyto-T y ATL1cyto-K. Incubar la mezcla en hielo durante una hora para obtener proteínas dimerizadas.
A continuación, para los ensayos smFRET intramoleculares, incubar LD555 y LD655 marcados con ATL1cyto-TK con un milimolar de GDP en hielo durante una hora. Para experimentos intermoleculares, incubar 10 microgramos por mililitro de estreptavidina durante 10 minutos para inmovilizar las proteínas. Para ensayos intramoleculares, añadir 10 microgramos por mililitro de anticuerpo anti-His biotinilado e incubar durante 10 minutos para inmovilizar las proteínas.
Después de la incubación, agregue el dímero ATL1 diluido a la proteína en el canal y deje que se inmovilice durante 10 minutos. Enjuague el canal dos veces con un tampón de incubación. Añadir ácido benzoico y PCD al canal a una concentración final de 2,5 milimolares.
Seleccione el láser de 532 nanómetros como fuente de luz de excitación. Configure la cámara EMCCD para que grabe datos en un intervalo de fotogramas de 30 milisegundos. Guarde las películas grabadas en formato TIFF de 16 bits.
Después de la adquisición de datos, extraiga las pistas FRET de las películas grabadas. Seleccione y guarde las pistas FRET en formato TXT. Extraiga los datos de los archivos TXT y calcule los valores de FRET mediante scripts caseros en MATLAB.
Ajuste los datos smFRET de GaussAmp en Origin para obtener el histograma de distribución.
