Desarrollamos un método de microscopía en tiempo real para la cuantificación de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs. Estos TNE desempeñan un papel importante en la defensa inmunitaria innata. Sin embargo, ha quedado claro que la acumulación de TNE en los tejidos contribuye a la fisiopatología de múltiples enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
Debido a las implicaciones patológicas de los TNE, ha aumentado el interés en el desarrollo de antagonistas de NETosis. Para estudiar la inhibición de NETosis, desarrollamos un método de microscopía en tiempo real para la cuantificación de la liberación humana de NET, lo que nos permite estudiar NETosis y su inhibición de una manera de alto rendimiento. Los neutrófilos son células sensibles y pueden cambiar su capacidad de respuesta a los estímulos durante el proceso de purificación debido al estrés mecánico, microbiano y otros tipos de estrés.
Por lo tanto, es importante validar el protocolo de aislamiento de neutrófilos para minimizar la activación de los neutrófilos. Por lo tanto, esta técnica permite el estudio de la liberación de NET tanto de individuos sanos como enfermos. Además, nos permite estudiar la cinética de formación de NET inducida por diferentes estímulos fisiológicos.
Con esta técnica de microscopía de alto rendimiento, pudimos demostrar que el antagonista de NETosis CIT-013, un anticuerpo monoclonal dirigido a las histonas citrulinadas 2A y 4, era capaz de inhibir eficazmente la liberación de NET con un nanomolar IC 50 o 4.6. Esto demuestra que este ensayo es adecuado para probar los antagonistas de NETosis. Después de recolectar sangre periférica del voluntario sano en un tubo de heparina de litio, transfiera la sangre a un tubo nuevo de 50 mililitros.
Enjuague el tubo de heparina de litio con DPBS y transfiéralo al mismo tubo de 50 mililitros, asegurándose de que la proporción de sangre a DPBS sea de 1:1. Después de mezclar, agregue sangre diluida sobre la solución de gradiente de densidad. Centrifugar la sangre a 400 g durante 40 minutos con una aceleración y un descanso mínimos.
Deseche la capa superior de plasma con una pipeta de 10 mililitros. A continuación, utilice una pipeta de plástico pasteur para desechar las células mononucleares de sangre periférica y la solución de gradiente de densidad. Agite suavemente la capa que contiene eritrocitos y neutrófilos antes de volver a suspenderla en 15 mililitros de DPBS.
Añadir 25 mililitros de solución de cloruro de sodio al 6% de dextrano y al 0,9% y mezclar invirtiendo el tubo. Después de 25 minutos de incubación, transfiera la capa superior de neutrófilos a un tubo nuevo de 50 mililitros con una pipeta de 10 mililitros y centrifugue a 500 G durante 10 minutos. Decantar el tubo para desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 10 mililitros de tampón de lisis potásica de cloruro de amonio.
Agregue 40 mililitros del mismo tampón de lisis e incube a temperatura ambiente mientras invierte continuamente el tubo hasta que la solución se vuelva translúcida. Centrifugar el tubo a 350 G durante 10 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, lentamente y gotamente, agregue cinco mililitros de medio de cultivo, 10% sobre la pastilla de neutrófilos sin poner los neutrófilos en suspensión.
Agite suavemente el tubo hasta que la mayoría de los eritrocitos presentes en la parte superior de la pelleta de neutrófilos se vuelvan a suspender en el medio de cultivo. Después de eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet de neutrófilos en 10 mililitros de medio de cultivo, 10%Una vez que se haya resuspendido completamente, agregue hasta 50 mililitros de medio de cultivo al 10% y centrifugue la mezcla antes de volver a suspender el pellet en 10 mililitros de trampa extracelular de neutrófilos o tampón de ensayo NET. Para comenzar, agregue una solución de poli-L-lisina al 0,001% a cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incube durante una hora a 37 grados centígrados.
Lave los pocillos tres veces con 200 microlitros de DPBS y seque los pocillos al aire. A continuación, vuelva a suspender el número requerido de neutrófilos en la trampa extracelular de neutrófilos o en el tampón de ensayo NET. Transfiera cuatro veces el tinte de ADN concentrado en el tampón de ensayo NET a cada pocillo.
Agregue cuatro veces los estímulos concentrados de NETosis en el tampón de ensayo NET a los pocillos correspondientes. A continuación, se añaden cuatro veces los antagonistas concentrados de NETosis en el tampón de ensayo NET y la suspensión de neutrófilos a los pocillos correspondientes. Centrifugar la placa a 100 G durante dos minutos.
Luego, inserte la placa en el sistema de análisis de microscopía de células vivas colocado en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de colocar la placa de imágenes de 96 pocillos que contiene la suspensión de neutrófilos en un sistema de análisis de microscopía de células vivas, abra el software del sistema. Haga clic en programar para adquirir y haga clic en el botón más para iniciar.
A continuación, seleccione Escanear según programación y haga clic en Siguiente. Para crear una nueva embarcación desde cero, seleccione nuevo en la sección crear embarcación y haga clic en siguiente. En la sección Tipo de análisis, seleccione Estándar y haga clic en Siguiente.
Seleccione la configuración de escaneo como celda por celda, ninguna. Canales de imagen, contraste de fase en verde. Tiempo de adquisición, 100 milisegundos y objetivo 20x.
A continuación, haga clic en Siguiente. En la sección Selección de embarcación, seleccione el tipo de embarcación adecuado para escanear y haga clic en Siguiente. Especifique la ubicación en el cajón de la embarcación y haga clic en Siguiente.
En la sección Patrón de exploración, seleccione los pocillos que se deben escanear y el número de imágenes por pozo. Haga clic en Siguiente. En la sección Cuaderno de la embarcación, proporcione información sobre la embarcación.
Introduzca el nombre de la placa y haga clic en Siguiente. En la sección Configuración de análisis, seleccione aplazar el análisis hasta más adelante y haga clic en Siguiente. En la sección Programación de análisis, seleccione crear una nueva programación con exámenes a intervalos de y seleccione una hora en la sección Agregar exámenes a la programación.
Seleccione Detener escaneo cinco horas después del primer escaneo. Haga clic en Siguiente y haga clic en Agregar para programar cuando la información de escaneo sea correcta. Después de adquirir imágenes de contraste de fase e inmunofluorescencia de neutrófilos, inicie el software de análisis de microscopía de células vivas.
En la vista, seleccione el experimento de microscopía de células vivas que se va a analizar. Seleccione Crear nueva definición de análisis y haga clic en Siguiente. A continuación, seleccione el analizador básico en la sección Tipo de análisis y haga clic en Siguiente.
En la sección Canal de imagen, seleccione verde, anule la selección de la fase y haga clic en Siguiente. Abra la ventana de capas de la imagen, seleccione verde y anule la selección de la fase. Desactive el escalado automático en la sección verde y establezca manualmente el mínimo y el máximo.
A continuación, abra la ventana de tiempos de escaneo de recipientes y seleccione las imágenes que representan pozos de control positivo con NET. Abra la ventana de configuración de definición de análisis y escriba NET para el nombre del objeto. Para la segmentación, seleccione Adaptativo.
Para la GCU de umbral, seleccione entre tres y cinco, y establezca la división de borde activada entre menos 10 y cero. A continuación, para la limpieza, seleccione Relleno de agujero a 100 micrómetros cuadrados y ajuste el tamaño a menos un píxel. En Filtros, seleccione el área superior a 200 micrómetros cuadrados, la intensidad media inferior a 24,6 y la intensidad integrada superior a 7.000.
A continuación, haga clic en Vista previa actual o Vista previa de todo para aplicar la configuración. Pase el cursor sobre las diferentes estructuras de NET y ajuste la configuración de análisis para ajustar las NET de falsos positivos y falsos negativos. Cuando la configuración del análisis NET sea correcta, haga clic en Siguiente.
Seleccione los puntos de tiempo y los pozos que desea analizar en la sección Tiempos de exploración y pozos y haga clic en Siguiente. Inserte el nombre de la definición en la sección Guardar y aplicar definición de análisis y haga clic en Siguiente. Haga clic en Finalizar cuando la información del análisis esté verificada y sea correcta.
Abra el análisis del experimento haciendo clic en el análisis dentro del recipiente de interés. A continuación, abra la ventana de métricas del gráfico. A continuación, haga clic en el botón más para crear una métrica.
Al presentar los datos como porcentaje de confluencia neta, seleccione Área en la sección Métrica y seleccione Confluencia en la sección Valor. Al presentar datos como un porcentaje de neutrófilos NETting, seleccione Recuento de objetos en la sección Métrica y seleccione Por imagen en la sección Valor. Después de configurar los ajustes de métricas, en la sección Métricas definidas por el usuario, seleccione Confluencia de área de NETs o Recuento de objetos de NETs por imagen.
Seleccione todos los puntos de tiempo y pozos necesarios para el análisis en las secciones Seleccionar escaneos y Seleccionar pozo, respectivamente. Por último, haga clic en Exportar datos. La estimulación del ionóforo de calcio indujo una NETosis más rápida en comparación con la PMA, lo que resultó en una mayor proporción de neutrófilos liberadores de NET.
Los TNE inducidos por ionóforos de calcio fueron más difusos más allá de la membrana plasmática de los neutrófilos, mientras que los TNE inducidos por PMA permanecieron más cerca de la membrana plasmática de los neutrófilos. Se observó una tendencia hacia niveles elevados de NET cuando los neutrófilos se activaron con inmunocomplejos recubiertos, FMLP y cristales de urato monosódico. La liberación de NET en respuesta a un 23187 fue completamente inhibida por CIT-013 a una concentración inhibitoria máxima media de 4,6 nanomolar.
