Cultivo de una biopelícula polimicrobiana relevante para la fibrosis quística para sondear los fenotipos de la comunidad

Estamos tratando de comprender cómo se comportan los microbios cuando se cultivan en condiciones que imitan las condiciones de la vida real, con el objetivo de determinar los mecanismos que impulsan los cambios fenotípicos en las comunidades de múltiples especies en comparación con el crecimiento de monocultivos. A través de la utilización de este sistema in vitro, hemos caracterizado una vía molecular que impulsa a los recalcitrantes de Pseudomonas aeruginosa, un patógeno notorio en el contexto de las infecciones de las vías respiratorias por fibrosis quística. Debido a su formato de placa de 96 pocillos y con condiciones de crecimiento que reflejan las observadas en el pulmón de fibrosis quística, podemos explorar una amplia gama de interacciones del microbioma con facilidad.

Hemos obtenido información sobre los mecanismos que subyacen a la susceptibilidad de los microbios a los antimicrobianos en un contexto totalmente microbiano. Nuestro modelo sirve como puente entre las observaciones clínicas y el trabajo de laboratorio individual en la investigación de la fibrosis quística, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar diversas interacciones del microbioma. Para comenzar, prepare todos los reactivos y medios necesarios.

Para el experimento de cocultivo, centrifugar los cultivos bacterianos durante la noche y lavar las células con PBS estéril. Después de centrifugar, deseche el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender cada pellet en un mililitro de medio de esputo artificial diluido en agua 1X o base ASM. Mida la densidad óptica de 1 a 10 muestras diluidas a 600 nanómetros en un espectrofotómetro o en un lector de placas.

Diluya cada muestra bacteriana hasta una densidad óptica final de 600 nanómetros de 0,01 y haga un vórtice completo durante cinco segundos. Agregue 100 microlitros de las suspensiones de monocultivo y cocultivo a tres pocillos separados de una placa de plástico estéril de fondo plano de 96 pocillos e incube la placa durante 24 horas a 37 grados Celsius en condiciones anóxicas. A continuación, con una pipeta multicanal, retire las células planctónicas sueltas y reponga las biopelículas preformadas con 100 microlitros de ASM fresco o el reactivo de tratamiento deseado.

Después de aspirar las células planctónicas, lave suavemente las biopelículas dos veces con 125 microlitros de PBS estéril y deseche la solución de lavado. Agregue 50 microlitros de PBS estéril. Y usando un replicador de 96 pines, raspó suavemente las células de la placa.

Transfiera las células de biopelícula resuspendidas a la fila A de una nueva placa estéril de 96 pocillos y realice una dilución en serie 10X. Coloque de tres a cinco microlitros de cada muestra de dilución en las placas de agar. Después de que las manchas de inoculación se sequen, incube las placas de manera adecuada.

Se observaron varios fenotipos, incluyendo una reducción en el número de recuentos de células viables de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus cuando se cultivaron en una comunidad planctónica mixta en comparación con el monocultivo. Se observó un aumento en el crecimiento polimicrobiano de Streptococcus sanguinis y un crecimiento de comunidad mixta de Prevotella melaninogenica.