La recidiva tumoral es un problema muy importante de la resección del parto. En este estudio, estamos tratando de comprender más sobre el crecimiento tumoral en un entorno regenerativo. Se ha demostrado que los organoides tumorales recapitulan histológica y genéticamente el tumor del paciente, aunque los modelos in vivo son escasos y carecen de estabilidad.
Hemos logrado injertar el organoide derivado del paciente en el hígado del ratón. Hemos mostrado esto para dos casos de ejemplo. Las tinciones inmunohistoquímicas histológicas muestran que los organoides y el xenoinjerto se asemejan al tumor original del paciente.
El desarrollo de organoides a partir del tumor original se asemeja a un modelo más preciso del tumor del paciente en comparación con otras posibilidades como los cultivos celulares en 2D. La incorporación de este modelo en el complejo entorno de la regeneración hepática ayudará a comprender mejor las interacciones existentes entre las células tumorales y el entorno regenerativo. Esperamos que adquiramos conocimientos en nuestro campo con respecto a la comprensión de la recurrencia del CHC de la resección hepática.
Por lo tanto, con este modelo, queremos crear las bases para futuros proyectos de investigación. Para comenzar, use un bisturí y fórceps para cortar el tejido de cáncer de hígado recolectado en pequeños fragmentos de uno a dos milímetros cuadrados. Transfiera los trozos de tejido a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de tampón de disociación.
Coloque el tubo en un dispositivo de rotación a 37 grados centígrados. Después de la incubación, pase la mezcla de células sobre un colador de células de 100 micrómetros colocado encima de un tubo de 50 mililitros. Use un émbolo de una jeringa de cinco mililitros para romper los fragmentos de tejido a través del filtro.
Ahora agregue cinco mililitros de DMEM avanzado suplementado sobre el filtro para lavarlo. Transfiera el filtrado a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos.
Vuelva a centrifugar la suspensión durante cinco minutos a 300 g. Luego vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS antes de contar. Antes de la colocación de la placa celular, retire el sobrenadante de la suspensión de la celda centrífuga.
Vuelva a suspender con aproximadamente un mililitro de matriz de membrana basal al tubo y colóquelo en hielo. Pipetee 20 microlitros de suspensión celular en los pocillos de una placa precalentada de seis pocillos para crear gotas. Después de esperar de dos a tres minutos, coloque la placa en posición invertida en un gabinete de flujo durante cinco minutos.
Luego transfiera la placa a una incubadora para solidificarla. Finalmente, agregue dos mililitros de medio de cultivo de organoides en cada pocillo. La línea de organoides derivada del paciente presentó características morfológicas del tumor original del paciente.
Para comenzar, coloque un ratón anestesiado en posición supina con las extremidades vendadas. Use fórceps y tijeras microquirúrgicas para hacer una incisión en el sitio quirúrgico agotado a lo largo del alba lineal desde la parte inferior del abdomen hasta el cartílago xifoides. Inserte los retractores en la incisión, ajustando la dirección de tracción para obtener una exposición óptima de la parte superior del abdomen.
Coloque una servilleta limpia humedecida con solución salina justo al lado del sitio de la incisión. Ahora, exterioriza el intestino delgado y el ciego sobre la servilleta húmeda. Exponga el lóbulo superior derecho hasta que sea posible una inyección.
Extrae la mezcla de organoides en una jeringa Hamilton con enjuague. Inyecte constantemente la suspensión en el ratón hasta la marca sin mover la aguja. Aplique presión con un hisopo de algodón en el lugar de la inyección.
A continuación, revise el abdomen para ver si hay rotura del lóbulo o reflujo. Enjuague el abdomen con 0,5 mililitros de solución salina estéril. Coloque una sutura corrida con una sutura reabsorbible para cerrar el abdomen.
El tumor desarrollado en el ratón se parecía tanto a los organoides derivados del paciente como al tumor original del paciente. Para comenzar una resección hepática menor, realice una laparotomía en un ratón anestesiado en posición supina. Con hisopos de algodón húmedos, empuje el lóbulo medial cranealmente para crear más espacio en el campo quirúrgico.
Voltea el lóbulo hepático lateral izquierdo cranealmente para exponer el lóbulo caudado y el ligamento. Corta el ligamento por completo. A continuación, inserte una ligadura por debajo del lóbulo lateral del hígado.
Ahora voltee el lóbulo hepático lateral izquierdo caudalmente y guíe el extremo libre izquierdo de la ligadura alrededor de la punta izquierda del lóbulo hepático lateral izquierdo. Guíe el extremo libre derecho alrededor de la otra punta. Use un hisopo de algodón para aplicar tracción en el lóbulo, asegurándose de que la ligadura esté colocada en el centro.
A continuación, haz un medio nudo doble. Asegure este nudo con otro medio nudo atado en la otra dirección sin apretarlo completamente. Cuando la ligadura esté colocada correctamente, sostenga el extremo libre del cráneo de la ligadura con pinzas de punta roma y tire del extremo caudal con otro par de pinzas.
Asegura el nudo con un segundo nudo atado en la dirección opuesta. Cortar cerca de la ligadura sin cortarla para resecar el hígado. Después de la resección menor del lóbulo hepático lateral izquierdo, seccionar el ligamento falciforme.
Voltea el lóbulo cranealmente, luego inserta una ligadura debajo de él y gíralo caudalmente. Ahora enrolle los ens libres de la ligadura alrededor del labial. Una vez que la ligadura esté colocada correctamente, haga lentamente un medio nudo doble.
Apriete completamente un segundo medio nudo en la dirección opuesta, luego agregue un tercer medio nudo en la dirección opuesta. Reseca el lóbulo y luego enjuaga el abdomen con solución salina estéril. Vuelva a colocar los intestinos en su lugar anatómico.
Para cerrar el abdomen, use fórceps para agarrar la piel y el peritoneo. Coloque un punto con una sutura reabsorbible en el extremo superior de la línea de incisión. Realice un segundo punto en el otro lado de la incisión, saliendo por el lado de la piel.
Haz el nudo con fuerza, dejando el extremo libre sin la aguja corto. Deja largo el extremo de la aguja del punto. Termine la sutura con un nudo en el extremo inferior de la incisión.
Limpia el abdomen de cualquier resto de sangre. La contribución relativa de los lóbulos hepáticos es comparable entre los diferentes ratones de la misma cepa. El peso medio del lóbulo inferior derecho aumentó hasta el 0,82% del peso corporal total después de la resección menor.
La resección mayor resultó en un aumento del 0,99% del peso corporal total. La resección mayor del lóbulo superior derecho resultó en un aumento pronunciado de su peso en relación con el lóbulo inferior derecho.
