Presentamos una nueva técnica de imagen con capacidad sin marcas, alta especificidad química y resolución subcelular. Nuestra metodología puede responder a preguntas sobre la disfunción metabólica en el envejecimiento y enfermedades como el cáncer La obtención de imágenes Raman, junto con la fluorescencia de dos fotones y la generación de segundos armónicos, ofrece una tecnología de imagen no destructiva y sin etiquetas que requiere una preparación mínima de la muestra y logra una alta resolución subcelular sin dañar la muestra celular. Varias modalidades de imágenes se operan como parte de nuestra plataforma.
Las personas deben seguir nuestro protocolo lo mejor que puedan, teniendo en cuenta que nuestro sistema está construido en casa. A lo largo del camino, deben desarrollar su propia práctica para garantizar el éxito. En dos tubos separados, comience midiendo y mezclando 10 miligramos de polvo de DMEM con 4,7 mililitros de agua destilada doble en un tubo cónico de 15 ml.
Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Para ambos tubos, agregue 4,7 ml de óxido de deuterio, 0,5 ml de FBS y 0,1 ml de penicilina y estreptomicina antes de vórtice e invertir el tubo. A continuación, agregue el exceso de fenilalanina a un tubo y el exceso de triptófano en polvo al segundo tubo y mezcle nuevamente.
Agregue metionina y treonina a 30 y 95 mg por ml, respectivamente, a ambos tubos, seguido de vórtice e inversión del tubo. A continuación, filtre los medios preparados con un filtro de jeringa de 25 milímetros con filtros de 0,22 micrómetros. Selle todos los medios contenidos en tubos cónicos con Parafilm.
Almacene los medios preparados a cuatro grados centígrados. Mantener las células sanadoras en un matraz de cultivo utilizando DMEM estándar suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina. Subcultive las células sanadoras en una proporción dividida de uno a 10 hasta alcanzar el 80% o más de viabilidad celular.
Antes de sembrar las células, sumerja los cubreobjetos redondos de 12 mm de diámetro de poli-D-lisina esterilizados, recubiertos de laminina, en etanol al 70%. Seque los cubreobjetos con toallitas sin pelusa y colóquelos limpios en los pocillos apropiados de la placa. Lavar las células una vez con PBS sin iones de magnesio y calcio.
Añadir 0,25% de tripsina para disociar las células de adherencia del matraz e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres minutos. A continuación, añada DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina a las células. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo.
Recoger las células por centrifugación a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender las células en DMEM suplementadas con 0,5% de FBS y 1% de penicilina y estreptomicina. Cuente las células teñidas con azul de tripano con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico y siembre a una densidad de dos veces 10 a la quinta célula por pocillo de una placa de 24 pocillos.
Distribuya las células uniformemente agitando suavemente la placa. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de ocho horas, reemplace el medio de cultivo antiguo con un 50 % de óxido de deuterio y un exceso de fenilalanina o un 50 % de óxido de deuterio y un exceso de triptófano.
Regrese las células a la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 36 horas. Ahora prepare portaobjetos de microscopio con espacios de imagen de nueve mm de diámetro. Coloque 15 microlitros de PBS, suplementados con iones de calcio y magnesio y enjuague las células con la misma solución.
Añadir 0,5 ml de solución de paraformaldehído sin metanol al 4% y dejar la placa bajo la cubierta de bioseguridad durante 15 minutos. Aspire la solución de paraformaldehído y enjuáguela con PBS, suplementado con hierro de calcio y magnesio dos veces. Agregue un ml de PBS, suplementado con iones de calcio y magnesio a cada pocillo.
Utilice pinzas estériles para quitar los cubreobjetos de cada pocillo con cuidado. Inviértalos y coloque el lado contenedor de la célula en los espacios de imagen en contacto con el PBS. Selle la capa exterior del cubreobjetos con el espaciador de imágenes con esmalte de uñas transparente.
Cargue la muestra biológica en el portamuestras directamente debajo de la lente del objetivo. A continuación, haga clic en el icono de la cámara en el software para encender la cámara de vídeo y ajustar el plano de enfoque para identificar una región de interés con el objetivo de 50X. Cambie a la lente del objetivo de 100X.
Haga clic en el icono de parada para apagar la cámara de vídeo. A continuación, seleccione una rejilla de 1.800 líneas por mm y ajuste el rango de adquisición de 400 a 3.150 centímetros inverso. Por último, establezca el tiempo de adquisición en 90 segundos, la acumulación en tres y el binning en cuatro para obtener el menor ruido y el espectro más preciso.
Haga clic en iniciar para calentar el láser. Comience presionando el interruptor principal de la caja de control IX3CBH a On, seguido del interruptor principal del controlador del panel táctil. Luego encienda el interruptor principal del adaptador de CA de la fuente de alimentación para LDOBIS6 control remoto láser conectado al peine del combinador láser principal FV31S.
Encienda también el adaptador de CA de la fuente de alimentación remota láser LDOBIS6 conectada al peine del combinador láser secundario FV31S. Después de eso, presione los interruptores principales del detector de fotodiodos SI y encienda el amplificador de bloqueo. Ajuste el láser IR a 1031 nanómetros Ajuste el sistema pico esmeralda a una longitud de onda sintonizable entre 720 y 990 nm.
Monte la muestra en el aceite y coloque una gota de agua grande en el portaobjetos del microscopio donde se fija la muestra. Seleccione el tamaño de escaneo como 512 por 512 píxeles. Adquiera y guarde las imágenes como un Olimpo.
Archivo gráfico OIR. Después de configurar la señal en 862.0, adquiera una imagen de fondo y guárdela. Ajuste el tiempo de permanencia a ocho microsegundos por píxel y el tamaño de píxel a 512 por 512 píxeles.
Ajuste el parámetro de potencia del obturador láser a 150 milivatios Para la reconstrucción de imágenes en 3D, ajuste la pérdida Raman estimulada a 2.850 cm inverso. Una vez que se hayan identificado las células individuales deseadas, registre el láser para escanear desde el plano de enfoque superior para detectar las capas superior e inferior de esas células. Se utilizó óxido de deuterio, sondeado, estimulado por dispersión Raman para visualizar la distribución espacial de las señales de CD en células individuales.
Las células control mostraron bandas moderadas de CD, lípidos y proteínas. Sin embargo, el viaje de 15 x v y 15 x mostró prohibiciones de lípidos y proteínas de CD más fuertes. El análisis cuantitativo indicó que el exceso de aminoácidos aromáticos puede aumentar la síntesis de lípidos en un 10 a 17%, pero regular a la baja la síntesis de proteínas en un 10%.
Se muestra la proyección de volumen de gotas lipídicas Raman 3D estimuladas en células sanadoras bajo control y condiciones de exceso de aminoácidos aromáticos. Los análisis cuantitativos de las gotas de lípidos en 3D mostraron un aumento en los recuentos, pero una reducción en el tamaño de las células tratadas con aminoácidos aromáticos en comparación con el control. Los parámetros de imagen para las imágenes fluorescentes Raman y de dos fotones deben optimizarse de una muestra a la siguiente para garantizar la mejor calidad de imagen.
Las personas pueden acoplar nuestro sistema con la generación de segundos armónicos para estudiar la estructura del colágeno, que dilucida los cambios metabólicos tempranos en el envejecimiento y las enfermedades, y comprender la progresión de la neurodegeneración o el cáncer. Nuestra tecnología es la primera de este tipo en visualizar la síntesis de lípidos y proteínas en sistemas biológicos con alta resolución subcelular. La tecnología también se puede trasladar a la clínica para la detección no invasiva de enfermedades.
