Hasta donde sabemos, este protocolo es el primero en producir matrices descelularizadas a partir del músculo esquelético fetal, proporcionando un enfoque novedoso para estudiar las miopatías que comienzan a desarrollarse en el útero. Este protocolo genera métricas específicas de desarrollo y tejido que se pueden utilizar para estudiar el comportamiento de las células musculares y las interacciones con la matriz extracelular en un entorno controlado. LAMA2-CMD es una distrofia muscular congénita que comienza a manifestarse al nacer.
Este modelo puede ayudar a desentrañar los mecanismos de patrón involucrados en su inicio y conducir a nuevas terapias objetivo. Este protocolo se puede adaptar a diferentes tejidos y modelos de enfermedades. Se pueden lograr diferentes niveles de complejidad dependiendo de la matriz y los tipos de células, lo que demuestra la versatilidad del sistema.
Este es un protocolo muy sencillo. La parte más difícil es la recolección y el manejo de las muestras. Pero, con la práctica, las habilidades técnicas se pueden mejorar fácilmente.
Comience transfiriendo un feto sacrificado a la vez a una placa de Petri que contenga PBS helado. Después de extirpar la piel y las extremidades, corte a través del lado ventral de la caja torácica. Extirpar el esternón y los órganos subyacentes.
Coloque el lado dorsal del feto hacia arriba y retire la porción cervical de la columna vertebral. A continuación, extirpe los depósitos de grasa dorsal y el tejido conectivo del músculo profundo de la espalda. Ahora, ancle la caja torácica con fórceps quirúrgicos.
Con un microbisturí, raspe cuidadosamente para separar los músculos profundos de la espalda del tejido circundante. Almacene los tejidos en PBS en una placa de cultivo celular de 12 pocillos a cuatro grados centígrados para su uso futuro. Durante un período más largo, almacene el tejido en un tubo de microcentrífuga vacío a menos 80 grados centígrados.
El primer día, use masas musculares epaxiales enteras. Agregue tres mililitros de tampón hipotónico que contenga 1% de penicilina y estreptomicina a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Agregue un fragmento de tejido muscular a cada pocillo e incube durante la noche durante 18 horas con agitación.
El segundo día, retire el tampón con una pipeta de punta fina. Ahora lave las muestras tres veces con tres mililitros de PBS con una agitación de una hora cada vez. Después de desechar el PBS, incubar las muestras en tres mililitros de solución detergente SDS al 0,05% durante 24 horas con agitación.
Al tercer día, use una pipeta fina para eliminar el detergente SDS y lave los fragmentos tres veces con tres mililitros de tampón de lavado hipotónico con una agitación de 20 minutos cada vez. Reemplace la solución de los pocillos con dos mililitros de solución de DNasa e incube los fragmentos de tejido a 37 grados centígrados durante tres horas con agitación. Después de retirar la solución de DNasa, lave los fragmentos tres veces con tres mililitros de PBS con una agitación de 20 minutos cada vez, dejando el último lavado durante la noche.
A un matraz T-25 sembrado con células C2C12 subconfluentes, añadir 500 microlitros de tripsina y resuspender en un mililitro de medio completo. Mezcle 10 microlitros de la suspensión con 10 microlitros de tinte azul de tripano y cárguelo en un hemocitómetro para contar el número de células y estimar la viabilidad. En una campana de flujo laminar, coloque las matrices descelularizadas, o dECM, en una placa de Petri que contenga PBS con 1% de penicilina y estreptomicina.
Usando un microbisturí y pinzas, separe las matrices en trozos pequeños. Transfiera los fragmentos a los pozos de una placa de 96 pocillos, colocando de tres a cuatro piezas por pozo. Agregue 200 microlitros de medio de cultivo completo precalentado en cada pocillo e incube la placa durante dos horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Deseche el medio en la placa del pozo y agregue 200 microlitros de medio de cultivo completo que contenga 50, 000 células C2C12 viables a cada pocillo. Incubar la placa del pozo durante dos días. Transfiera los dECM con las células a una placa de 48 pocillos que contenga 400 microlitros de medio de cultivo completo.
Aspirar el medio cuidadosamente cada dos días para evitar el desprendimiento de la matriz y reponer con el medio fresco hasta el octavo día. Para la diferenciación, reemplazar el medio de cultivo completo con un medio de diferenciación e incubar durante cuatro días hasta el día 12. El tejido muscular fue rojizo inmediatamente después del aislamiento y se volvió blanco debido a la lisis celular después de la incubación en tampón hipotónico.
SDS hace que los músculos se vuelvan transparentes. Después del tratamiento con DNasa, se obtuvo una dECM más pequeña y transparente. La cuantificación del ADN revela una disminución de casi el 100% en los dECM en comparación con el tejido nativo.
Los dECM y el tejido nativo mostraron tinción tubular similar para la laminina alfa dos y la proteína laminina. El análisis Western blot del tejido nativo mostró dos bandas para la subunidad laminina alfa dos, mientras que se detectaron tres bandas más pequeñas en la dECM. Para las lamininas totales, las muestras de dECM mostraron fragmentación de proteínas en comparación con el tejido nativo.
La fibronectina y el colágeno I estaban presentes en el espacio intersticial entre las células del tejido nativo y las dECMs. Bandas similares de fibronectina estuvieron presentes en ambas muestras, lo que indica que no se ve afectada por la descelularización. Se observaron menos bandas de colágeno I en los dECM.
Para el colágeno IV, ambas muestras mostraron tinción tubular similar. Sin embargo, el peso molecular de las bandas dECM fue menor. Las células C2C12 colonizaron y proliferaron en los dECM y se fusionaron en miotubos multinucleados.
Estos expresaron proteína de cadena pesada de miosina después de cuatro días de incubación en medio de diferenciación. Se observó tinción intracelular y pericelular para laminina alfa de dos cadenas, lamininas totales y fibronectina. Los andamios esqueléticos de ratón fetal descelularizados se pueden usar para cultivar células en sistemas de cocultivo, acercándolo a la situación in vivo y, por lo tanto, contribuye a comprender la enfermedad muscular.
