Este protocolo permite las evaluaciones locales tanto de la arquitectura del colágeno como de las características de falla mecánica del tejido fibroso de la placa. Dado que las evaluaciones estructurales y mecánicas se realizaron en la misma muestra de tejido, esta técnica permite desentrañar el vínculo funcional entre las evaluaciones estructurales y mecánicas del tejido. El conocimiento obtenido con este protocolo sobre la estructura del tejido de la placa fibrosa y las características de fallo es clave para prevenir y predecir eventos clínicos fatales desencadenados por la ruptura de la placa aterosclerótica.
Para comenzar, corte la placa abierta a lo largo del eje longitudinal de la arteria con tijeras quirúrgicas y pinzas. Recorte muestras de prueba rectangulares de las muestras de placa, asegurándose de que las muestras sean lo más grandes posible y evitando las regiones de tejido que contienen desgarros o calcificaciones. Luego, tome una muestra de prueba de placa y fije ambos extremos a la silicona clavando agujas en el tejido.
Inserte las agujas en la región de la muestra que estará en las abrazaderas del dispositivo de prueba de tracción durante la prueba mecánica. Póngase gafas de seguridad. Use un cortador lateral para acortar las agujas de modo que sobresalgan a menos de unos pocos milímetros por encima de la superficie de la muestra para evitar que dañen el objetivo del microscopio.
Llene la placa de Petri con PBS hasta que la muestra esté sumergida. A continuación, encienda el sistema de microscopio, gire la tecla multifotónica y abra el software operativo del microscopio. Coloque la placa de Petri que contiene la muestra de prueba debajo del objetivo y baje el objetivo del microscopio.
Active el modo de escaneo en vivo. Mueva el objetivo a una esquina de la muestra con las perillas del panel inteligente y haga clic en el símbolo de posición de marca en el panel Escaneo de mosaico. Si se realiza correctamente, aparecerá una cuadrícula con todos los mosaicos seleccionados para la creación de imágenes en naranja.
A continuación, haga clic en Inicio en la esquina inferior derecha de la pantalla para crear un escaneo en mosaico de toda la superficie de la muestra para obtener una visión general de la geometría de la muestra. Después del escaneo de mosaicos, observe las coordenadas X e Y de la esquina superior izquierda del mosaico superior izquierdo en el panel Escaneo de mosaico que se muestra automáticamente. Anote estas coordenadas en una hoja de cálculo.
En el panel Escaneo de mosaico, observe el número de mosaicos en las direcciones X e Y en el cuadro denominado ScanField. Tenga en cuenta el tamaño del escaneo de mosaico en la hoja de cálculo. Calcula las coordenadas de los otros mosaicos sumando o restando el tamaño del mosaico.
En el escaneo de mosaicos, seleccione los mosaicos que se van a fotografiar con una segunda generación de armónicos o imágenes SHG. Para la selección, evite las baldosas en las abrazaderas y deje una baldosa entre cada baldosa seleccionada tanto en la dirección longitudinal como en la circunferencial. A continuación, identifique la ubicación de los mosaicos de los que se va a crear una imagen utilizando las coordenadas calculadas en esta hoja de cálculo.
Rellene las coordenadas en los cuadros designados y haga clic en Entrar para que el objetivo se mueva al mosaico derecho. Active el modo de escaneo en vivo. Aumente la potencia del láser multifotón, o MP, utilizando el control deslizante en el panel superior y la configuración de la trayectoria del haz para obtener la mayor potencia láser posible sin blanqueamiento significativo.
Luego, ajuste la ganancia del detector para obtener imágenes brillantes sin píxeles saturados utilizando la perilla en el panel inteligente o haciendo clic en el nombre del detector y la configuración de la trayectoria del haz y canales adicionales. Los valores típicos para la ganancia del detector están entre 500 y 800 voltios. Utilice la perilla de posición Z del panel inteligente para ajustar el plano de enfoque.
A continuación, desplácese a la parte superior de la muestra y establezca las posiciones de la parte superior de la pila Z haciendo clic en la punta de flecha en el panel de la pila Z en la pestaña Adquisición del tercer panel. Luego, concéntrese en la muestra hasta que ya no se detecte la señal SHG. Nuevamente, haga clic en la punta de flecha en el panel Z-stack para establecer esta posición.
Cuando haya terminado, desactive el modo de escaneo en vivo. En la pestaña Adquisición del segundo panel, mantenga la velocidad de escaneo en 400 hercios, establezca el promedio de línea en dos y la resolución en 512 por 512 píxeles por imagen utilizando las listas desplegables. Active el botón de escaneo X bidireccional.
Haga clic en el tamaño del paso z en el panel de la pila Z y rellene un tamaño de paso z de tres micras en el cuadro. Haga clic en Inicio en la esquina inferior derecha de la pantalla para crear una pila Z. Cuando haya terminado, guarde las coordenadas del mosaico en el nombre del archivo o asigne a cada mosaico su número.
Después de la obtención de imágenes, la muestra se expone a pruebas mecánicas. Para generar un patrón de spackle, sostenga el aerógrafo lleno de tinte de tejido a aproximadamente 30 centímetros de distancia de la muestra de prueba y rocíelo sobre la superficie lumenal. A continuación, para la prueba de tracción uniaxial, coloque la muestra en las abrazaderas del probador de tracción con la dirección circunferencial de la muestra alineada con la dirección de estiramiento de tracción y el lado lumenal de la muestra hacia arriba.
Asegúrese de que la longitud del calibre inicial esté configurada de modo que la relación ancho-longitud de la tira sea inferior a uno. Apriete los tornillos de las empuñaduras aplicando un par de 20 centímetros metros utilizando un destornillador dinamométrico. Agregue PBS al baño de calentamiento hasta que la muestra esté sumergida.
Desgarre la célula de carga y comience a registrar las mediciones globales de fuerza y desplazamiento de la célula de carga y el actuador del probador de tracción. Enderezar la muestra aplicando un preestiramiento de 0,05 newton para eliminar la holgura de la muestra. Realice 10 ciclos de preacondicionamiento, hasta un 10% de deformación, según la medición de la longitud del medidor por el actuador después de la aplicación del preestiramiento.
Inicie la prueba de tracción uniaxial hasta que falle completamente la muestra mientras graba un video de la deformación de la muestra con la cámara de alta velocidad. Después del fracaso, deje de registrar las mediciones globales de fuerza y desplazamiento. Abra las pilas Z obtenidas durante la microscopía multifotónica, o MPM, con SHG en la Imagen J y cree proyecciones de intensidad máxima, o MIP, de cada pila Z.
Analice cada MIP con la herramienta de análisis de orientación de fibra basada en MATLAB de código abierto para medir el ángulo de orientación de las fibras de colágeno individuales presentes en las baldosas. Utilice otra herramienta basada en MATLAB, FibLab, para ajustar una distribución gaussiana al histograma de distribución de ángulos. De la gráfica de distribución gaussiana, extraiga los parámetros estructurales como el ángulo de fibra predominante, que es el modo de la distribución, la desviación estándar de la distribución del ángulo de fibra y la fracción anisotrópica.
Realice una inspección visual de las imágenes de la cámara para identificar el fotograma en el que se produce el inicio de la ruptura. Identifique visualmente la ubicación de la ruptura. Realice el análisis de correlación de imágenes digitales, DIC, con software basado en MATLAB utilizando las imágenes de la cámara grabadas durante la prueba de tracción.
Seleccione el último fotograma antes del estiramiento final hasta el error como imagen de referencia. Para las imágenes actuales, seleccione todas las imágenes desde el inicio del estiramiento final hasta el último fotograma antes del fotograma en el que se produjo el inicio de la ruptura. Seleccione la superficie de muestra como región de interés o ROI.
Excluya las áreas que están cerca de las abrazaderas. Realice DIC estableciendo el radio del subconjunto del parámetro en 30 píxeles, el espaciado entre subconjuntos en tres píxeles, el límite de iteración en 50, la norma del límite del vector de diferencia en 10 para la potencia de cinco, el radio de deformación para cinco y el paso de autopropagación para cinco. A partir del análisis DIC con ncorr, obtener las distribuciones de cepas de Green-LaGrange o Eulerian del ROI.
Utilice estas distribuciones de deformación para calcular la tensión promedio de Green-LaGrange de toda la superficie de la muestra de placa en el último fotograma antes de la ruptura. Calcule la tensión de Green-LaGrange en el lugar de ruptura. Utilizando los puntos de referencia naturales de la muestra de prueba, realice una superposición de la imagen de referencia y el escaneo de mosaico para identificar la ubicación de ruptura en el escaneo de mosaico.
Identifique el mosaico MPM-SHG donde ocurrió la ruptura. Si la ruptura no está en una baldosa escaneada con el MPM-SHG, identifique la baldosa más cercana a la ubicación de la ruptura. Obtenga los parámetros estructurales encontrados en la baldosa donde ocurrió la ruptura.
Aquí se muestra una muestra de placa fresca e intacta con poco o ningún desgarro y macrocalcificaciones. Las muestras de placa pueden recuperarse de áreas que no incluyen estos desgarros y calcificaciones. Las imágenes SHG y el posprocesamiento de imágenes proporcionan MIP de cada mosaico de imagen.
El postprocesamiento adicional mediante detección de fibra produce histogramas de orientación de fibra de los cuales se pueden extraer parámetros estructurales de colágeno. Además, se obtienen mapas de color que muestran los parámetros estructurales locales de colágeno en toda la muestra de placa para el análisis visual. A partir de estas muestras de ensayo, se observó una gran variación intramuestra en los parámetros estructurales de colágeno.
El inicio de la ruptura y la propagación en una muestra de tejido de placa durante la prueba de tracción se demuestran aquí. El análisis de correlación de imágenes digitales proporciona mapas locales de deformación tisular, como los mapas de cepas de Green-LaGrange. A partir de estos mapas de cepas, se observó una gran variación intramuestra en las cepas locales.
Una vez que se identifica la ubicación de ruptura en las grabaciones de la cámara, se puede asignar de nuevo a la imagen de referencia de la cámara y al escaneo de mosaico de microscopía. Esto proporciona la baldosa MPM-SHG donde ocurrió la ruptura y los parámetros estructurales encontrados en esta baldosa. La obtención de muestras de tejido fibroso que están libres de calcificaciones y son de un tamaño lo suficientemente grande para trabajar para pruebas mecánicas puede ser una tarea difícil para las placas fuertemente calcificadas.
Una vez que se identifica una característica mecánica o estructural como predictor de insuficiencia del tejido de la placa fibrosa, un sistema de imágenes in vivo que mida esta característica permitirá predecir el riesgo de ruptura de placa en pacientes.
