该协议能够对纤维斑块组织的胶原结构和机械故障特征进行局部评估。由于结构和机械评估都是对同一组织样本进行的，因此该技术可以揭示组织结构和机械评估之间的功能联系。通过该协议获得的关于纤维斑块组织结构和失效特征的知识是预防和预测动脉粥样硬化斑块破裂引发的临床致命事件的关键。
首先，使用手术剪刀和镊子沿动脉纵轴切开斑块。从斑块标本中切出矩形测试样品，确保样品尽可能大，同时避免含有撕裂或钙化的组织区域。接下来，取牙菌斑测试样本，并通过在组织中插针将其两端固定在硅胶上。
在机械测试期间，将针插入将位于拉伸测试装置夹具中的样品区域。戴上安全眼镜。使用侧切刀缩短针头，使其在样品表面上方伸出不到几毫米，以防止它们损坏显微镜物镜。
用PBS填充培养皿，直到样品被淹没。接下来，打开显微镜系统，转动多光子键，打开显微镜的操作软件。将含有测试样品的培养皿放在物镜下方并降低显微镜物镜。
打开实时扫描模式。使用智能面板上的旋钮将物镜移动到样品的一角，然后单击"平铺扫描"面板中的标记位置符号。如果执行正确，包含所有选定用于成像的切片的网格将以橙色显示。
接下来，单击屏幕右下角的"开始"，创建整个样品表面的平铺扫描，以获得样品几何形状的概览。磁贴扫描完成后，在自动显示的"平铺扫描"面板中观察左上角磁贴左上角的 X 和 Y 坐标。在电子表格中记下这些坐标。
在"平铺扫描"面板中，在名为"扫描场"的框中观察 X 和 Y 方向上的图块数。记下电子表格中磁贴扫描的大小。通过添加或减去图块的大小来计算其他图块的坐标。
从切片扫描中，选择要使用二次谐波生成或 SHG 成像进行成像的切片。对于选择，请避免夹具中的瓷砖，并在纵向和圆周方向的每个选定瓷砖之间留出一个瓷砖。接下来，使用此电子表格中的计算坐标确定要成像的切片的位置。
在指定的框中填写坐标，然后单击 Enter 以使目标移动到右侧磁贴。打开实时扫描模式。通过使用上面板上的滑块和光束路径设置来增加多光子或 MP 激光功率，以获得尽可能高的激光功率，而不会发生明显的漂白。
然后，通过使用智能面板上的旋钮或单击探测器的名称以及光束路径设置和其他通道，调整检测器增益以获得没有饱和像素的明亮图像。检波器增益的典型值在 500 至 800 V 之间。使用智能面板上的 Z 位置旋钮调整对焦平面。
然后，移动到样品顶部，并通过单击第三个面板的"采集"选项卡下的 Z 堆栈面板中的箭头来设置 Z 堆栈顶部的位置。然后，专注于样品，直到不再检测到SHG信号。再次单击"Z 堆栈"面板中的箭头以设置此位置。
完成后，关闭实时扫描模式。在第二个面板的采集选项卡下，使用下拉列表将扫描速度保持在 400 赫兹，将线平均值设置为 2，并将分辨率设置为每张图像 512 x 512 像素。打开双向 X 扫描按钮。
单击 Z 堆栈面板中的 z 步长，然后在框中填充 3 微米的 z 步长。单击屏幕右下角的开始以创建 Z 堆栈。完成后，将磁贴的坐标保存在文件名中，或为每个磁贴指定编号。
成像后，样品将接受机械测试。要生成 spackle 图案，请将充满组织染料的喷枪与测试样品约 30 厘米处保持距离，然后将其喷洒在管腔表面上。接下来，对于单轴拉伸测试，将样品放在拉伸测试仪的夹具中，样品的圆周方向与拉伸拉伸方向对齐，样品的管腔面朝上。
确保设置初始标距长度，使带材的宽长比小于 1。使用扭矩螺丝刀施加 20 厘米米的扭矩来拧紧夹具的螺钉。将PBS加入加热浴中，直到样品浸没。
撕下称重传感器，开始记录来自称重传感器和拉伸测试仪执行器的全局力和位移测量值。通过施加 0.05 牛顿的预拉伸来拉直样品以消除样品中的松弛。根据应用预拉伸后执行器测量的标距长度，执行 10 个周期的预调节，最高可达 10% 应变。
开始单轴拉伸测试，直到样品完全失效，同时用高速相机记录样品变形的视频。失败后，停止记录全局力和位移测量值。在图像J中使用SHG打开在多光子显微镜（MPM）期间获得的Z堆栈，并创建每个Z堆栈的最大强度投影或MIP。
使用基于 MATLAB 的开源纤维取向分析工具分析每个 MIP，以测量瓷砖中存在的单个胶原纤维的取向角。使用另一个基于 MATLAB 的工具 FibLab 将高斯分布拟合到角度分布直方图。从高斯分布图中，提取结构参数，例如主要纤维角度，即分布的模式，纤维角度分布的标准差和各向异性分数。
对相机图像进行目视检查，以确定发生破裂起始的帧。目视识别破裂位置。使用拉伸测试期间记录的相机图像，使用基于 MATLAB 的软件 ncorr 执行数字图像相关 （DIC） 分析。
选择最终拉伸直到失败之前的最后一帧作为参考图像。对于当前图像，选择从最终拉伸开始到发生破裂起始的帧之前的最后一帧的 ll 图像。选择样品表面作为感兴趣区域或ROI。
排除夹具附近的区域。通过将参数的子集半径设置为 30 像素、将子集间距设置为 3 像素、将迭代截止设置为 50、差向量截止的范数设置为 10 的 5 次方、应变半径设置为 5 和自传播步长设置为 5 来执行 DIC。从带有ncorr的DIC分析中，获得ROI的格林-拉格朗日或欧拉应变分布。
使用这些应变分布来计算破裂前最后一帧整个斑块样品表面的平均格林-拉格朗日应变。计算破裂位置处的格林-拉格朗日应变。使用测试样本中的自然地标，对参考图像和磁贴扫描进行叠加，以识别磁贴扫描上的破裂位置。
确定发生破裂的 MPM-SHG 磁贴。如果破裂不在使用 MPM-SHG 扫描的瓷砖中，请确定最靠近破裂位置的瓷砖。获取在发生破裂的瓷砖上找到的结构参数。
此处显示的是新鲜且完整的斑块样本，几乎没有撕裂和大钙化。斑块样本可以从不包括这些撕裂和钙化的区域取回。SHG 成像和图像后处理提供来自每个成像切片的 MIP。
通过纤维检测进行进一步的后处理，产生纤维取向直方图，从中提取胶原蛋白结构参数。此外，还可以获得显示整个斑块样品的局部结构胶原蛋白参数的彩色图，以进行视觉分析。从这些测试样品中，观察到结构胶原蛋白参数的样品内差异很大。
本文演示了拉伸试验期间斑块组织样品中的破裂起始和扩散。数字图像相关分析提供局部组织变形图，例如格林-拉格朗日应变图。从这些菌株图中，观察到局部菌株的样品内变化很大。
一旦在相机记录中确定了破裂位置，就可以将其映射回参考相机图像和显微镜切片扫描。这提供了发生破裂的 MPM-SHG 磁贴以及在此磁贴上找到的结构参数。对于严重钙化的斑块来说，获得没有钙化且尺寸足够大且可用于机械测试的纤维组织样本可能是一项具有挑战性的任务。
一旦机械或结构特征被确定为纤维斑块组织衰竭的预测因子，测量该特征的体内成像系统将允许预测患者的斑块破裂风险。
