Nuestro trabajo lleva los esfuerzos de reconstitución del citoesqueleto un paso importante más cerca de imitar las condiciones celulares mediante la ingeniería de compuestos de actina y microtúbulos, impulsados por motores de quinesina y miosina para sintonizar, reestructurar y moverse activamente. La dinámica y la estructura de nuestros compuestos se pueden programar con precisión añadiendo, eliminando y ajustando independientemente los diferentes componentes para exhibir una rica base de fase de contracción, infección, nebulización, engrosamiento y ruptura. Nuestro enfoque es ampliamente aplicable para diseñar, crear y caracterizar plataformas de materia activa que incorporan múltiples componentes generadores de fuerza que actúan sobre diferentes sustratos en un solo sistema.
Demostrando el procedimiento estarán Daisy Achiriloaie y Maya Hendija. Investigadores de pregrado de nuestro laboratorio. Para comenzar, agregue los reactivos a un tubo de microcentrífuga negro estéril de 1.5 mililitros usando una micropipeta y puntas de pipeta estériles para formar grupos motores de kinesina que se unen y ejercen fuerzas entre pares de microtúbulos.
Mezclar suavemente pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo. Luego incube la solución durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, protéjala de la luz. Para preparar una red compuesta coentrelazada de filamentos de actón y microtúbulos, ajuste el bloque de calor a 37 grados centígrados.
Agregue los reactivos a un tubo de microcentrífuga estéril de 0,6 mililitros. Asegúrese de que el volumen total sea de 25 microlitros. Pipetea suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclarla y colócala en el bloque de calor de 37 grados centígrados protegido de la luz durante una hora.
Después de eso, retire el tubo del bloque de calor y use una micropipeta para mezclar suavemente 0.84 microlitros de 100 micromolar Phalloidin. Incubar durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Para preparar compuestos activos para imágenes focales conf, agregue los reactivos a la solución y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Divida la solución en tres alícuotas de 10 microlitros y etiquételas como K, K más M y control negativo. Añadir 2,54 microlitros de miosina a la alícuota K más M y 2,54 microlitros de PEM a K y alícuotas de control negativo. Luego agregue 2.5 microlitros de racimos de kinesina a K y K más alícuotas M y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
A continuación, agregue 2.5 microlitros de PEM al control negativo utilizando la misma técnica. Utilice una micropipeta para hacer fluir lentamente cada solución hacia el canal correspondiente de las cámaras de muestra a través de la acción capilar. Empuje hacia abajo muy lenta y suavemente sobre la pipeta para no introducir burbujas de aire en el canal.
Selle los dos extremos abiertos de cada canal con epoxi de secado rápido o pegamento curable UV. Cuando el adhesivo esté completamente seco, coloque el canal en el microscopio para obtener imágenes del compuesto lo más cerca posible del estado inactivo inicial. Imagine el canal K y los canales K más M primero seguidos del canal de control.
Tenga en cuenta el tiempo transcurrido entre la adición de los clústeres de Kinesin a K y K más las alícuotas M y el comienzo de la adquisición de datos. Para preparar actina para actina o reticulantes AA, agregue Biotina-Actina, NeutrAvidina, Biotina y PEM a un tubo de microcentrífuga y mézclelos suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Del mismo modo, para microtúbulos a microtúbulos o reticulantes MM, agregue Biotina-tubulina, NeutrAvidina, Biotina y PEM a un tubo de microcentrífuga y mézclelos suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Envuelva el tubo en una película de techo termoplástica para crear un sello hermético y colóquelos en una balsa de flotación en un baño de sonicater con temperatura controlada, ajustado a cuatro grados centígrados durante 90 minutos. Para incorporar complejos de reticulación A-A en muestras para obtener imágenes, agregue los reactivos a un tubo de microcentrífuga. Asegúrese de que el volumen total sea de 25 microlitros.
Del mismo modo, para complejos de reticulación M-M, agregue los reactivos que se muestran en la pantalla a un tubo de microcentrífuga. Mezcle la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo y colóquela en el bloque de calor de 37 grados centígrados protegido de la luz durante una hora. Después de eso, retire el tubo del bloque de calor y use una micropipeta para mezclar 0.84 microlitros de 100 micromolar faloidina.
Incubar durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz y repetir el procedimiento mostrado anteriormente para preparar compuestos activos para imágenes confocales. Las monofibras de actina y los dímeros de tubulina se copolimerizan para formar redes coentrelazadas de filamentos de actina y microtúbulos. Los dos mini filamentos de miosina y los grupos de kinesina empujan y tiran de los filamentos para expulsar a los compuestos del estado estacionario.
La reticulación pasiva se logra utilizando NeutrAvidin para unir filamentos de actina biotinilados o microtúbulos. Los mini filamentos de miosina, los grupos de kinesina o ambos motores se incorporan en compuestos sin enlaces cruzados pasivos, enlaces cruzados actina-actina y enlaces cruzados microtúbulos-microtúbulos. Aquí se muestran dos imágenes confocales en color de compuestos de citoesqueleto impulsados por miosina con concentraciones variables de miosina y fracciones molares de actina.
La velocimetría de imágenes de partículas muestra que la actividad de la miosina de actina desencadena una dinámica contráctil coordinada de actina y microtúbulos en compuestos coentrelazados. Aquí, diferentes colores de flecha corresponden a diferentes velocidades como se indica en la escala de colores a la derecha de los campos vectoriales. La microscopía dinámica diferencial resuelta en el tiempo se realiza en microtúbulos y canales de actina de series temporales para determinar las características de los tiempos de decaimiento frente al número de onda tanto para la actina como para los microtúbulos.
Las velocidades de contracción se determinan a través de ajustes a curvas de tiempo de decaimiento, promediadas en todos los tiempos de retraso durante toda la duración de cada serie de tiempo de 45 minutos. La microscopía dinámica diferencial resuelta en el tiempo cuantifica cómo varía la dinámica con el tiempo mediante la evaluación de los tiempos de desintegración para intervalos consecutivos de seis minutos durante el tiempo de activación de 45 minutos para la actina y los microtúbulos. Las velocidades de contracción resueltas en el tiempo para filamentos de actina y microtúbulos se determinan a partir de ajustes a las curvas de tiempo de decaimiento correspondientes.
El análisis de autocorrelación de imágenes espaciales cuantifica la reestructuración motora de los componentes citoesqueléticos activos mediante la comparación de curvas de correlación automática para las diferentes redes al comienzo del experimento en comparación con el final. Las longitudes de correlación resueltas en el tiempo determinadas a través de ajustes exponenciales de curvas de correlación automática muestran compuestos que no se reestructuran en comparación con aquellos que se reestructuran sustancialmente. Dos imágenes confocales en color de compuestos de microtúbulos de actina impulsados por Kinesin muestran una reestructuración dependiente de la formulación a lo largo del tiempo sin que los compuestos de reticulación se reestructuren en grupos ricos en microtúbulos poco conectados.
La reticulación actina-actina apoya la colocalización de los microtúbulos de actina, mientras que la reticulación microtúbulo-microtúbulos mejora la mezcla D. La microscopía dinámica diferencial y el análisis de autocorrelación de imágenes espaciales muestran el efecto de los motores de micina y kinesina que varían en el tiempo y la estructura de los compuestos. Para imitar las condiciones celulares más de cerca, los investigadores pueden incorporar filamentos intermedios, otros motores y proteínas de unión que controlan las longitudes y rigideces de los filamentos.
También se pueden realizar mediciones de metrología de pinzas ópticas para caracterizar la mecánica compuesta. Usando nuestro enfoque, los investigadores pueden ajustar con precisión la dinámica y la estructura de la materia activa compuesta inspirada en el citoesqueleto en un espacio de fase sin precedentes para emular diversos procesos celulares y diseñar materiales programables reconfigurables.
