El sistema de ensayo de transcripción in vitro para Borreliella burgdorferi proporciona una herramienta bioquímica para que los investigadores estudien los mecanismos reguladores de genes y los factores que gobiernan la actividad enzimática de la ARN polimerasa. El sistema nos permite probar cómo los factores de transcripción, los cofactores, las concentraciones de sal y el pH afectan la función de la ARN polimerasa de Borreliella burgdorferi, lo que contribuye a nuestra comprensión general de los mecanismos reguladores de genes. Esta poderosa técnica también puede permitirnos detectar medicamentos que inhiben selectivamente la ARN polimerasa, abriendo la puerta al desarrollo de nuevos medicamentos para tratar la borreliosis de Lyme.
Para comenzar, recoja el pellet celular de dos a cuatro litros de Borreliella burgdorferi RpoC-His10X cultivado en medio BSKII en un ambiente microaerofílico a una densidad de dos a cuatro veces 10 constantes por mililitros. Granular las células a 10, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en botellas centrífugas de 500 mililitros y desechar el sobrenadante. Luego, resuspenda las celdas en 30 mililitros de tampón HN helado, repita el paso de centrifugación y decanta el sobrenadante.
Mientras trabaja, mantenga las células, el lisado y las proteínas purificadas a cuatro grados centígrados o en hielo a menos que se congelen. Mantenga la ARN polimerasa en un ambiente reductor agregando ditiothreitol recién preparado a una concentración de dos milimolares a cada tampón utilizado y mantenga un pH 8.0. Prepare lisado a partir del pellet de células de Borreliella burgdorferi utilizando un kit de lisis bacteriana comercial.
Resuspender el pellet en 10 a 15 mililitros de solución de B-PER sin inhibidor de la proteasa y dejar que la lisis proceda durante cinco minutos en hielo. Agregue un cóctel inhibidor de proteasa a la solución de lisis y proceda con tres rondas de sonicación. Ahora aclare el lisado celular por centrifugación y filtración utilizando un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Agregue un tampón de carga de columna de cobalto a la solución, lo que hace que el volumen total sea de hasta 30 mililitros. Granular los restos celulares por centrifugación a 20, 000 veces G durante 30 minutos. Posteriormente, filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros y diluya el tampón de carga de la columna de lisado y cobalto hasta una relación de dilución final de 1:10.
Realice cromatografía de afinidad en el sobrenadante de lisado celular clarificado utilizando una columna de resina de cobalto o níquel siguiendo las instrucciones del fabricante. Guarde las muestras de flujo, lavado y eluido para su análisis. Cambie inmediatamente la solución tampón de solución de ARN polimerasa con la solución tampón de almacenamiento utilizando una columna de intercambio de tampón siguiendo las instrucciones del fabricante.
Luego, concentre la ARN polimerasa a una concentración de 0.2 a 0.4 miligramos por mililitro utilizando unidades de filtro centrífugas de corte de 10 kilodaltons. Determinar la concentración mediante espectrofotómetro y preparar las existencias de congelación. Alícuota 20 a 50 microlitros de volúmenes de ARN polimerasa congelación en tubos de PCR y almacenar la ARN polimerasa a menos 80 grados centígrados.
Prepare las superficies de trabajo, incluido el banco de radiación, para reducir la contaminación por radiación. Descongele las existencias frescas de ARN polimerasa y RpoD en hielo y mezcle completamente todas las existencias congeladas descongeladas antes del pipeteo Prepare una mezcla de reacción maestra en una mezcla de NTP separada para nucleótidos radiomarcados de acuerdo con los requisitos experimentales. Dispensar las reacciones de control en series experimentales en tubos de PCR.
Después de dispensar agua, mezcla de reacción, ARN polimerasa y RpoD en tubos de PCR designados, mezcle los reactivos por pipeteo. Transfiera los materiales preparados a un banco de radiación, agregue ATP marcado con alfa-32P a NTP y mezcle con un pipeteo suave. Agregue NTP a los tubos que contienen las mezclas de reacción de transcripción in vitro e inicie la reacción de transcripción in vitro agregando una plantilla de ADN.
Mezcle el volumen de reacción pipeteando suavemente e incube los tubos a 37 grados centígrados durante cinco minutos en un termociclador o bloque de calor. Elimine las reacciones del termociclador o bloque de calor y detenga las reacciones de transcripción in vitro agregando un volumen igual de colorante de carga de ARN 2X que contenga 50% de formamida a la mezcla de reacción. Desnaturalizar las enzimas incubando reacciones a 65 grados centígrados durante cinco minutos en un termociclador o bloque de calor.
Usando electroforesis en gel, separe el ARN transcrito in vitro en geles de poliacrilamida de urea 10% a 15% TBE a 180 voltios durante 30 a 45 minutos. Después de eliminar cualquier porción del gel que contenga ATP radiomarcado no incorporado, exponga el gel a la pantalla de fosfo durante la noche y obtenga una imagen del ARN radiomarcado utilizando un generador de imágenes de fosfopantalla. El SDS-PAGE mostró tres bandas correspondientes a tres péptidos, RpoC, RpoB y RpoA del complejo ARN polimerasa.
También se observó un péptido de 115 kilodaltons que coincidía con el tamaño de la Borreliella burgdorferi RpoD recombinante marcada con MBP. La escisión de la mezcla de proteínas con la proteasa del factor XA condujo a la generación de dos productos significativos, RpoD y MBP. El sitio promotor de Borreliella burgdorferi FLGB fue generado por PCR.
Una dilución doble de la concentración de RpoD da lugar a un nivel más bajo del producto de ARN acumulado. Una baja concentración de ARN polimerasa proporciona menos productos de ARN en todo el rango de concentraciones de RpoD. La señal de densitometría indicó una relación lineal entre la cantidad de RpoD presente en la reacción en ambos experimentos.
La actividad enzimática de la ARN polimerasa es sensible a una variedad de factores durante el proceso de purificación, almacenamiento y experimentación. Las enzimas y reactivos frescos, junto con una buena planificación, brindan la mejor oportunidad posible de éxito en este protocolo.
