La disección manual del intestino de este elegan es una técnica poderosa pero simple que permite la investigación de varios aspectos de la postbiología mediante el aislamiento de tejido en poblaciones específicas de células. Esta técnica de disección de tejido a escala fina es fácil de realizar y utiliza equipos de laboratorio estándar, lo que la convierte en un método robusto y accesible para muchos. Comience tirando del capilar de vidrio estándar de 4 pulgadas de largo y 1.2 milímetros de diámetro exterior en forma de aguja de inyección usando un extractor de agujas.
Preparar al menos 5 pipetas microcapilares de 50 y 100 micrómetros. Use una micro forja para forjar las pipetas microcapilares a 50 micrómetros o 100 micrómetros marcando 3 o 5 marcas de verificación respectivamente como lo indica la regla ocular de micro forja debajo de la lente objetivo 5X. Luego coloque una pipeta microcapilar en el tubo aspirador bucal.
Prepare un baño M9 y un baño amortiguador de disección agregando 2 mililitros de M9 en una placa de Petri estéril de 35 milímetros de diámetro y 2 mililitros de tampón de disección a la otra placa de Petri estéril de 35 milímetros de diámetro. Finalmente, agregue 100 microlitros de albúmina sérica bovina de trabajo o solución BSA a cada baño, y mezcle agitando. Para preparar la matriz de disección, agregue 150 microlitros de solución de levamisol de trabajo al primer pozo del portaobjetos de concavidad de dos pozos y 150 microlitros de tampón de disección al segundo pozo.
Agregue 20 microlitros de solución BSA funcional a cada pozo. Para diseccionar a mano el intestino del gusano caenorhabditis elegans CL2122, mueva 20 gusanos adultos del medio de crecimiento del nematodo o placa NGM al baño M9 usando un pico de gusano. Luego mueva los 20 gusanos del baño M9 al baño de disección.
A continuación, mueva lotes de 10 gusanos del baño amortiguador de disección al pozo que contiene solución de levamisol. Una vez que el movimiento del gusano disminuya rápidamente, muévalos del pocillo de levamisol al pozo que contiene el tampón de disección. Permita que los gusanos comiencen a moverse un poco en el búfer de disección mucho antes de comenzar la disección.
Bajo un endoscopio de disección fluorescente, haga un corte justo detrás de la faringe o delante del recto usando una aguja hipodérmica para producir un número igual de secciones de la mitad media anterior y la mitad media posterior del intestino. Mientras espera aproximadamente un minuto para que los intestinos se extruyan al máximo del cuerpo, agregue 50 microlitros de tampón de quelación al pozo para ayudar a reducir la degradación del ARN. Para facilitar la extrusión intestinal, utilice la pipeta microcapilar de 100 micrómetros unida a un aspirador bucal y extraiga el gusano dentro y fuera de la pipeta.
Una vez que un intestino esté suficientemente extruido, use la aguja hipodérmica de calibre 27 para cortarlo del resto del cuerpo y de cualquier gónada restante. Aspirar la sección de intestinos utilizando la pipeta microcapilar y transferirla al tubo de microcentrífuga que contiene el reactivo de aislamiento de ácido nucleico. Mantenga los intestinos aislados en hielo y repita el procedimiento para los intestinos restantes.
Este método demostró la disección y el aislamiento exitosos de los intestinos. El método también informó sobre el aislamiento de ARN y la vigilancia microbiana de intestinos aislados. Como los gusanos CL2122 albergaban el metal específico del intestino dos promotores fusionados con GFP, el intestino se observó como un resplandor verde bajo el telescopio de disección fluorescente.
La disección del gusano adulto mostró un intestino extruido después de hacer una incisión primaria justo detrás de la faringe. La disección exitosa de un segmento intestinal apareció libre de contaminantes visibles como restos de la gónada o el cadáver. En contraste, la disección fallida mostró la gónada y la carcasa unidas al segmento intestinal.
Los rendimientos de ARN de la disección manual fueron más eficientes ya que la muestra final de 60 secciones intestinales totales produjo aproximadamente 15 nanogramos de ARN total de alta calidad. La desagregación de gusanos y el aislamiento de células intestinales por FACS fueron menos eficientes, ya que requerían cientos de miles de células intestinales para obtener cantidades proporcionales de ARN total. La amplificación total del ADN genómico microbiano utilizando un ensayo de detección panbacteriana mostró que la muestra final de 40 secciones intestinales totales de las regiones anterior, media y media posterior produjo la cantidad baja pero detectable de alrededor de 0,009 picogramos de ADN microbiano total.
Lo más importante que debe recordar al realizar este procedimiento es no paralizar demasiado los gusanos antes de la disección, ya que esto puede inhibir la extrusión intestinal máxima.
