Nuestro protocolo permite la obtención simultánea de imágenes de la dinámica de la microglía y la actividad neuronal en ratones despiertos. Se puede aplicar ampliamente para investigar el comportamiento de vigilancia de la microglía o la interacción con las neuronas. La ventaja de este método es que los artefactos de movimiento no contaminan fácilmente los datos de imágenes debido a la fijación robusta de la cabeza.
Además, la restauración después de la imagen a la alta velocidad de fotogramas nos permite eliminar el artefacto de movimiento de los datos. En este método, la inyección de AAV y la cirugía de implantación de ventana craneal son técnicamente exigentes. El fracaso es común al principio, así que por favor no te frustres y practica más.
Para preparar el aparato de inyección, coloque una pipeta de vidrio conectada a una jeringa Hamilton de calibre 26 a través de un tubo en un soporte de pipeta de un instrumento estereotáxico. A continuación, incline el soporte de la pipeta 60 grados anteriormente desde el eje vertical. Llene la pipeta de vidrio, la jeringa y el tubo de conexión con parafina líquida y coloque la jeringa en un microinyector.
Administrar analgesia al ratón anestesiado y colocar las barras auxiliares para los oídos. Luego, fije al animal en el instrumento estereotáxico con su lado dorsal hacia arriba. Después de eliminar el vello del sitio quirúrgico y desinfectar el área quirúrgica, haga una incisión de dos centímetros de largo en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media, asegurando una buena exposición del cráneo por encima de la corteza visual primaria derecha.
Use fórceps para extraer el periostio en el cráneo expuesto. Perfora el cráneo en las coordenadas estereotáxicas tres milímetros laterales a la línea media y 5 mililitros anteriores a la línea lambda para crear un pequeño agujero con un diámetro de aproximadamente 0,5 milímetros. Luego, coloque un trozo de película transparente de aproximadamente dos centímetros por dos centímetros sobre el cráneo expuesto del ratón.
Expulse una gota de solución AAV de un microlitro en la película con un pipeteo. Avance la jeringa. Y coloque una punta de pipeta de vidrio en la gota de solución AAV en la película y tire suavemente de la jeringa para aspirar la solución AAV.
A continuación, inserte la pipeta de vidrio a una profundidad de 500 micrómetros desde la superficie del cerebro a través del orificio creado en el cráneo. Luego, inyecte 0.5 microlitros de solución AAV usando el microinyector a una tasa de flujo de volumen de inyección de dos microlitros por hora. Retire la aguja y enjuague la superficie del cerebro con solución salina.
Cree una ranura circular a lo largo de la marca en el cráneo perforando. Limpie los residuos para garantizar la visibilidad del cráneo y aplique solución salina para evitar el calentamiento durante la perforación. Presione suavemente el cráneo central con fórceps.
La profundidad de perforación es suficiente si se mueve verticalmente con poca resistencia. Cuando el surco alcance suficiente profundidad, inserte la punta de los fórceps en la parte inferior del fragmento central del cráneo. Levante y retírelo suavemente para exponer la superficie del cerebro.
Con una aguja de calibre 27, pinche y rasgue la duramadre en el borde de la superficie cerebral expuesta. Inserte la punta de los fórceps a través del orificio hecho en el borde de la duramadre y despéguela para exponer la superficie del cerebro. Después de dispersar las fibras hemostáticas una por una en solución salina, coloque las fibras hemostáticas a lo largo de los márgenes del orificio en el que está presente la duramadre transectada.
Coloque la ventana craneal en la superficie cerebral expuesta y luego adhiérala al cráneo con pegamento instantáneo mientras presiona suavemente la ventana. Después, aplique pegamento instantáneo a todo el cráneo expuesto. Luego, coloque cuidadosamente una placa de cabeza en el cráneo para ubicar la ventana craneal en el centro del orificio cuadrado de la placa de cabeza.
Una vez que el pegamento se haya endurecido lo suficiente, aplique cemento dental al cráneo expuesto para reforzar la unión entre la cabeza y la hoja de la cabeza. Para instalar el dispositivo de sombreado personalizado y un monitor LCD para la estimulación visual, primero coloque la lente para enfocar la superficie del cerebro y luego establezca esta posición de lente como la posición Z original. Mantenga las coordenadas XY constantes y eleve la lente del objetivo.
Retire el ratón y el instrumento estereotáxico de la lente del objetivo. Coloque un dispositivo de sombreado en la parte superior de la placa de la cabeza con silicona, asegurándose de que el espacio entre la placa principal y el dispositivo de sombreado esté bien sellado. Llene el dispositivo de sombreado con agua destilada.
Luego, fije el mouse con el marco estereotáxico debajo de la lente del objetivo. Restablezca cuidadosamente el plano focal en la superficie del cerebro, verificando la profundidad de la lente del objetivo. Cubra la lente del objetivo con papel de aluminio negro para evitar la contaminación lumínica del monitor LCD.
Coloque un monitor LCD de 10 pulgadas a 12,5 centímetros frente a los ojos del ratón para presentar estímulos visuales. Configure los filtros de recolección de envío fluorescente para EGFP y R-CaMP y la longitud de onda de excitación a 1.000 nanómetros. Adquiere imágenes con una resolución espacial de 0,25 micras por píxel.
Encuentre la región de imágenes donde se pueden obtener imágenes simultáneas de las neuronas R-CaMP positivas y la microglía positiva para EGFP. En la capa 2, 3. Adquiere imágenes a una velocidad de fotogramas de 30 hercios.
Simultáneamente con la adquisición de la imagen, presente estímulos visuales de rejilla a la deriva al ratón en 12 direcciones en seis orientaciones, de cero a 150 grados en pasos de 30 grados. Después de la adquisición de la imagen, retire el ratón de la etapa de microscopio. Separe el dispositivo de sombreado y el instrumento estereotáxico del ratón y devuelva el ratón a su jaula de origen.
Usando este protocolo, la inyección de AAV y la implantación de ventana craneal se realizaron en la corteza visual primaria de un ratón transgénico de ocho semanas de edad, seguidas de dos imágenes de fotones de actividad neuronal basada en R-CaMP y dinámica microglial en la capa 2, 3. Se presentaron estímulos visuales de rejilla al ratón y se analizaron las respuestas visuales en la columna adendrítica utilizando trazas de calcio. Los procesos microgliales mostraron una dinámica rápida y cambiaron su morfología en 10 segundos.
Usando imágenes de dos fotones en la capa 2, 3 de la corteza visual primaria en un ratón transgénico de 12 semanas de edad, se observó R-CaMP en neuronas, visto aquí en magenta. Se observó un EGFP en microglia, visto en verde. También se observaron señales individuales para EGFP y R-CaMP.
La inyección exitosa de AAV es crítica para este método. Las principales razones para la inyección fallida de AAV son las pipetas de vidrio del reloj y el daño tisular. Se ha identificado que el comportamiento de vigilancia de la microglía y la interacción de la microglía de SNAP prevalecen en varios mecanismos patogénicos, como la enfermedad de Alzheimer.
Nuestro método es beneficioso para la investigación centrada en este campo.
