El cultivo ex vivo puede obstaculizar el potencial de repoblación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas. Nuestro protocolo preserva el tallo durante el cultivo y, por lo tanto, mejora la frecuencia de las células modificadas genéticamente in vivo. La terapia génica con células madre hematopoyéticas se está empleando actualmente para enfermedades monogénicas y enfermedades infecciosas como el VIH.
El protocolo de terapia génica HSPC se basa en gran medida en el cultivo ex vivo. Nuestro protocolo debe ser compatible con cualquier procedimiento que emplee cultivo ex vivo. Demostrando este protocolo estará Vigneshwaran Venkatesan, estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Después de aislar las HSPC, cultivarlas en medios de cultivo de células madre que contengan citoquinas y moléculas pequeñas Resveratrol, UM729 y StemRegenin1. Antes de la edición de genes, ajuste el ThermoMixer a 37 grados centígrados para reconstituir el ARN guía, luego precaliente el tampón TE a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Centrifugar el vial de sgRNA sintético modificado químicamente a 11, 000 veces g durante 1 minuto a 4 grados Celsius y agregar 15 microlitros de tampón TE al vial que contiene 1.5 nanomolar de sgRNA liofilizado y mezclar mediante un suave remolino para obtener una concentración final de 100 picomolares por microlitro.
Incubar el vial en el ThermoMixer con una agitación mínima a 37 grados centígrados durante 30 a 40 segundos. Golpee suavemente el vial en los lados y gire el vial para recoger 15 microlitros de sgRNA. Haga alícuotas de 1 microlitro y guárdelas a menos 80 grados centígrados durante un máximo de 1 año.
Para la nucleofección, pellet 2 veces 10 a las 5ª células centrifugando a 200 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez desechado el sobrenadante, resuspender el pellet en 20 microlitros del tampón. Mezclar suavemente la suspensión celular con el complejo RNP preparado evitando burbujas de aire.
Ahora, transfiera la suspensión a la tira de nucleofección comercial y electropolara las células utilizando el 4D-Nucleofector seleccionando el código de pulso DZ-100. A las células electroporadas en la tira de nucleofección, agregue 100 microlitros de medios de cultivo preincubados y deje las células intactas durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, transfiera el contenido a la placa de cultivo según los requisitos experimentales.
Coloque los ratones NSG en las jaulas de pastel de 6 a 8 horas antes del trasplante de HSPC. Irradiar los ratones a 3,5 gray utilizando un irradiador disponible comercialmente. Para NBSGW, preacondicionar ratones machos y hembras de 6 a 8 semanas de edad inyectando busulfano por vía intraperitoneal a una dosis de 12,5 miligramos por kilogramo de peso corporal 48 horas antes del trasplante de HSPC.
Para infundir 1 ratón, pellet 6 veces 10 a las 5ª células en un tubo de 1,5 mililitros centrifugando a 200 veces g durante 5 minutos. a temperatura ambiente. Pipetear suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet y resuspender el pellet celular en 100 microlitros de PBS.
Coloque los ratones NSG o NBSGW preacondicionados en el retenedor de ratón e infunda las HSPC mediante inyección en la vena de la cola. Sostenga la cola del mouse y empuje suavemente el tapón para sujetar el mouse. Limpie suavemente la cola del ratón con etanol al 70%.
Usando una jeringa de insulina calibre 31, aspire 100 microlitros de la suspensión celular. Ahora, dirija la luz de la lámpara infrarroja a la cola durante 30 a 40 segundos, cubriendo el área del cuerpo del ratón con pliegues de papel de seda. Para mantener la cola en el eje de la cepilladora con la jeringa, levántela con el dedo índice izquierdo.
Inserte suavemente la parte biselada de la aguja en la vena caudal izquierda o derecha de la cola en un ángulo de 20 grados. Empuje el émbolo para infundir la suspensión celular en la vena y aplique una presión suave cerca de la región perforada con papel de seda y saque la aguja. Después de anestesiar, coloque al animal en decúbito ventral y frote suavemente a los ratones para abrir el ojo, permitiendo que el globo del ojo sobresalga ligeramente.
Inserte suavemente la pipeta de pasto en un ángulo de 30 a 45 grados en el canto medial del ojo debajo de la membrana nictitante. Después de colocar la pipeta Pasteur en la posición correcta, aplique una ligera presión en el tubo y comience a girar suavemente el tubo. Después de recolectar de 50 a 80 microlitros de sangre periférica, retire suavemente la pipeta del canto medial del ojo.
Después de la eutanasia, haga una incisión vertical 1 centímetro por encima de la uretra y extienda hasta 1 centímetro por debajo del diafragma. Corte horizontalmente en las esquinas del área incisa para abrir la región abdominal. Después de diseccionar el fémur y la tibia, use tijeras para eliminar los tejidos blandos adheridos al fémur y la tibia y frote suavemente los huesos con un papel de seda.
Use un bisturí para hacer un pequeño agujero con un diámetro de no más de 0,2 centímetros en el fondo de un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Retire los extremos proximales de los huesos con un bisturí y coloque los huesos con el lado cortado mirando hacia el orificio del tubo de microcentrifugación de 0,5 mililitros. Ahora, coloque el tubo de 0.5 mililitros con los huesos en el tubo de 1.5 mililitros que contiene 100 microlitros de PBS estéril.
Cierre la tapa, gire los tubos a 200 veces g durante 3 minutos en condiciones estériles a temperatura ambiente y deseche los tubos de 0,5 mililitros que contienen huesos con una cavidad de médula vacía. Al tubo de reacción de 1.5 mililitros que contiene médula ósea, agregue 1 mililitro de PBS, luego usando una pipeta de 1 mililitro, resuspenda suavemente las células 10 veces. Transfiera 1 mililitro de la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros que contenga 9 mililitros de tampón de lisis RBC.
Incubar las células en hielo durante 7 minutos invirtiendo suavemente el tubo cada dos minutos. Después de la incubación, centrifugar el tubo a 200 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente y repetir el lavado hasta que se observe una bolita blanca clara y pálida. La frecuencia de células vivas y CD34 positivas, CD90 positivas ha aumentado en el grupo RUS después de 48 horas de nucleofección.
Después de 72 horas, el porcentaje y la frecuencia de indel aumentaron en el grupo tratado con RUS en comparación con el grupo tratado con DMSO, lo que sugiere un aumento en la edición de genes. El número absoluto de células CD34 positivas, CD90 positivas y células nucleadas totales es significativamente mayor 48 horas después de la edición. El análisis de citometría de flujo de células CD45 positivas humanas en ratones NSG mostró un aumento del injerto en las condiciones de cultivo.
El análisis de la frecuencia de edición de genes en las células BM de ratón mostró un aumento del injerto de HSPC editadas genéticamente en condiciones de cultivo suplementadas con RUS. Cultivar las HSPC en una confluencia de 200, 000 células por ml es crucial para mejorar las células madre funcionales. La amplificación de las células madre de la sangre del cordón umbilical y las células madre derivadas de iSPC son las nuevas áreas en las que se está probando este protocolo.
