Hemos desarrollado un método eficiente y económico para establecer ratones con manipulación génica específicamente en células madre hematopoyéticas, utilizando la tecnología de edición del genoma y sistemas de administración de transgén mediados por lentivirus. La ventaja de este protocolo es que podemos crear modelos animales que albergan mutaciones específicas en células hematopoyéticas de una manera rápida y rentable en comparación con los enfoques transgénicos convencionales de ratón. Demostrando el procedimiento estará Ying Wang, un investigador de mi laboratorio.
Para generar partículas de lentivirus, comience codificando una placa de seis pozos con solución de colágeno e incubando a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante 30 minutos. Luego, siembra células 293T en la placa e incuba durante otras dos horas. Mientras tanto, preparar la mezcla de tres plásmidos de transfección combinando 0,9 microgramos de lentivirus vector, 0,6 microgramos de psPAX2 y 0,3 microgramos de pMD2.
G y desionizado a 10 microlitros por pozo. A continuación, añadir cuidadosamente 50 microlitros de 1X PBS y cinco microlitros de PEI MAX diluido a la mezcla de plásmido, e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro de DMEM.
Aspirar el medio de la placa de seis pozos y añadir un mililitro de mezcla de plásmido a cada pozo. Incubar el plato durante otras tres horas. Sustituya el soporte por DMEM fresco e incubar durante 24 horas.
Añadir un mililitro de DMEM fresco e incubar 24 horas adicionales. Después de una incubación total de 48 horas, transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros y centrifugarlo a 3000 veces G durante 15 minutos para eliminar las células flotantes libres. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micrómetros y ultra-centrifugarlo durante tres horas.
Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando atrás el pellet blanco. Re-suspenda el pellet con 100 microlitros de medio de expansión celular hematopoyética sin suero sin aireación. Mantenga una alícuota de 10 microlititer para medir el título viral y almacene el resto de la suspensión en menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para usar.
Después de aislar los huesos, colóquelos en un tubo cónico de 50 mililitros con RPMI y coloque el tubo sobre hielo. En un gabinete de biosemase, transfiera los huesos a un plato estéril de cultivo de 100 milímetros. A continuación, agarre un hueso con fórceps contundentes y use tijeras de disección para cortar cuidadosamente ambas epífisis.
Llene una jeringa de 10 mililitros con RPMI helada y utilice una aguja de calibre 22 para lavar la médula ósea del eje en un nuevo plato de cultivo de 100 milímetros. Después de recoger toda la médula ósea, haga una suspensión de una sola célula pasando la médula ósea a través de una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 18. Filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.
A continuación, centrifugar el tubo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender los pellets celulares en un volumen adecuado de búfer de separación optimizado. Para aislar las células negativas del linaje, utilice un kit de agotamiento de células de linaje de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Re-suspenda las células negativas de linaje aislado en un medio de expansión de células hematopoyéticas sin suero. Pre-incubar las células a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono durante dos horas. Luego agregue lentivirus de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y deje las células en la incubadora durante otras 16 a 20 horas.
Al día siguiente, recoger las células transducidas por lentivirus en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugarlas a 300 veces G durante 10 minutos. De acuerdo con las directrices de la NHA, es importante manejar los vectores de lentivirus en el nivel dos del Grupo Reece. Se deben tomar precauciones, de acuerdo con las regulaciones de la instalación.
Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 200 microlitros de RPMI por ratón. Mantenga las células a temperatura ambiente hasta el trasplante en ratones. Después de la segunda sesión de irradiación, inyecte retro-orbitalmente células negativas delineatorias transducidas en cada ratón anestesiado utilizando una jeringa de insulina.
De tres a cuatro semanas después del trasplante de médula ósea, obtenga muestras de sangre de la vena retro-orbital utilizando tubos capilares. Transfiera 20 microlitros de sangre a tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo y colóquelos sobre hielo. Después de la lelisis RBC, incubar las células con un cóctel de anticuerpos monoclonales en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Después de la incubación, lavar, fijar y centrifugar las células y volver a suspender el pellet celular en 400 microlitros de tampón FACS. Mantenga las muestras a cuatro grados centígrados hasta su análisis por citometría de flujo. El éxito de la transducción de células negativas de linaje se puede evaluar con la detección citométrica de flujo de RFP.
Se ha demostrado que después de siete días de cultivo in vitro, en promedio, 75,7% de las células son transducidas. La citometría de flujo también se ha utilizado para analizar la sangre periférica del ratón después de la reconstitución con células madre hematopoyéticas transducidas y no transducidas. Un promedio de 94,8% de los neutrófilos, 93,5% de los monocitos y 82,7% de las células B expresan RFP.
El ADN genómico de las células sanguíneas positivas rfP ha sido amplificado por PCR y subclorado para el análisis de secuencia. Se detectan varias mutaciones y el 69% de los clones muestran mutaciones fuera de fotograma o de parada prematura. Para tener éxito con este procedimiento, se requiere la preparación de un alto stock antivirus y condiciones optimizadas para la transducción y trasplante de células hematopoyéticas.
Hemos aplicado esta técnica para estudiar la ley de la enfermedad cardiovascular. Pero también es útil estudiar la neoplasia maligna hematológica. Este método nos permite estudiar las funciones de nuevos tipos de genes en el sistema hematopoyético de alta eficiencia y alta manera.
Reunimos esto sobre la disponibilidad de ratones transgénicos.
