Este protocolo se establece para aislar e identificar las células linfoides innatas del grupo dos de la mucosa nasal murina y explorar ciertos efectos y mecanismos subyacentes de la ILC dos en enfermedades nasales. Esta técnica permite a los investigadores aislar ILC dos del mesotelial local y exponer la expresión del antígeno de superficie mediante citometría de flujo. Nuestra técnica no incluye operaciones complicadas.
Sin embargo, una cosa importante es tratar de eliminar la carne que se adhiere a los pequeños huesos por completo para evitar el impacto de otros tejidos cercanos. Antes de comenzar el experimento, aloje ratones machos y hembras machos y hembras de tipo C57 negro salvaje de 8 a 12 semanas en condiciones específicas libres de patógenos provistas de comida de laboratorio estándar y agua. Para establecer el modelo de rinitis alérgica, emulsionar 50 microgramos de ovoalbúmina en 0,2 mililitros de PBS estéril que contiene dos miligramos de hidróxido de aluminio e inyectar intraperitonealmente 50 microgramos de ovoalbúmina emulsionada en cada ratón en cero, siete y 14 días. En los días 21, 22, 23, 24 y 25, instilar intranasalmente ratones con 50 microgramos de ovoalbúmina disuelta en 30 microlitros de PBS estéril, seguido de la eutanasia de los ratones 24 horas después del último desafío.
Remoje la cabeza del ratón sacrificado en etanol al 75% durante cinco minutos y evite que el etanol entre en la fosa nasal externa. Coloque el abdomen hacia abajo en la mesa de operaciones. Corte los cuatro dientes y en la línea media de la cabeza haga una incisión y abra la piel con tijeras.
Luego, retire la mandíbula inferior, corte toda la nariz a lo largo del extremo del paladar y coloque el tejido en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga cinco litros de PBS helado. Usando tijeras y fórceps, retire la carne y los músculos adheridos a los huesos. A continuación, transfiera la nariz del ratón a una nueva placa de Petri de 60 milímetros que contenga cinco mililitros de PBS helado y lave los huesos.
Después del segundo lavado, transfiera la nariz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Aplaste suficientemente el tejido y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de tampón de digestión precalentado. Cierre la tapa y coloque el tubo verticalmente en un agitador orbital a 37 grados centígrados y de 120 a 150 RPM durante 40 minutos.
A continuación, agregue cinco mililitros de RPMI 1640 medio helado que contenga 10% de suero bovino fetal para detener la digestión. Luego filtre el contenido a través de un filtro de células de 70 micras para eliminar fragmentos sólidos. Después de centrifugar el filtrado a 500 G durante cinco minutos, deseche suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en medio RPMI 1640 helado.
Para repetir la centrifugación como se demostró anteriormente, resuspenda el pellet celular en cuatro mililitros de medio de gradiente de densidad del 40%. A continuación, inserte suavemente una pipeta Pasteur en el fondo del tubo para agregar 2,5 mililitros de medio de gradiente de densidad del 80%. Centrifugar el tubo a 400 G durante 15 minutos a temperatura ambiente con la velocidad de aceleración y desaceleración ajustada por debajo de la tercera marcha.
Antes de drenar las células en la interfaz, retire la capa superior de impurezas para evitar una posible contaminación. Luego use una pipeta para drenar la capa de células mononucleares en la interfaz de medios de gradiente de 40% por 80% de densidad en un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de hielo frío. Lave las celdas con PBS helado dos veces.
Cosechar las células y centrifugarlas durante cinco minutos a 500 g a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el pellet celular en tampón de tinción y centrifugar de nuevo durante cinco minutos a 500 G.Deseche el sobrenadante. Resuspender e incubar las células en solución de bloqueo de 80 microlitros durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en condiciones oscuras.
Agregue un microlitro de colorante de viabilidad reparable 520 justo antes de agregar 20 microlitros del cóctel de anticuerpos de tinción superficial de la dilución adecuada a la muestra. Además, establezca los anticuerpos de isotipo coincidentes y la fluorescencia menos uno como controles negativos. A continuación, lave las células en 500 microlitros de tampón de tinción centrifugando a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Luego resuspender el pellet celular en 200 microlitros de tampón de tinción. Finalmente, agregue 50 microlitros de perlas de conteo absoluto de vórtice a las células teñidas. Agitar y someterlos a un análisis de citometría de flujo.
Un modelo murino inducido por óvulos desarrollado para explorar el papel de las células linfoides innatas del grupo dos mostró que la frecuencia de frotamiento nasal y estornudos en los ratones con rinitis alérgica fue significativamente mayor que en el grupo de control. En la mucosa nasal de ratones control sanos, se identificaron alrededor del 2 al 3% de las células de linaje negativo y CD 45 positivas. El número absoluto de células linfoides innatas del grupo dos varió de 2.000 a 4.000.
El análisis de citometría de flujo indicó un aumento notable en el número total de células linfoides innatas del grupo dos en la mucosa nasal de rinitis alérgica en comparación con el de ratones control sanos. Se detectó una mayor expresión de CD 226 en las células linfoides innatas del grupo dos en los ratones con rinitis alérgica que en los ratones control. Además, la intensidad media de fluorescencia de CD 226 se reguló significativamente al alza en los ratones AR.
Tenga en cuenta los pasos para eliminar la carne adherida al hueso nasal, establecer la velocidad de aceleración y desaceleración al centrifugar el medio y drenar las células mononucleares. Las ILC dos identificadas pueden ser un soporte para la caracterización de citometría de flujo ordenada para cultivo celular o estimulada in vitro, lo que ayudaría a explorar el riesgo específico de ILC dos en el tejido nasal. Este procedimiento de aislamiento y caracterización de linfocitos, particularmente en células linfáticas innatas en la mucosa nasal, hace de este protocolo una referencia preliminar para los investigadores que exploran el entorno inmune nasal local.
