En los últimos años, la encapsulación dentro de vesículas bicapa lipídicas del tamaño de una célula ha demostrado ser un método útil para experimentos de reconstitución in vitro. El método que presentamos ayudará en gran medida con la reconstitución del citoesqueleto en la investigación de células sintéticas. Con este método, podemos generar vesículas unilamelares gigantes de tamaño heterogéneo con un alto rendimiento.
El tiempo de generación de vesículas se reduce significativamente en comparación con la técnica cDICE convencional. Podemos encapsular sistemas de transcripción-traducción libres de células aislados de procesos celulares complejos y simultáneos para examinar las vías moleculares. Este método se puede utilizar para ensamblar protocélulas mínimas hacia la creación de células sintéticas funcionales.
Comience a preparar una mezcla de aceite y lípidos transfiriendo dioleoil-fosfocolina, colesterol y rodamina PE a un vial de vidrio de 15 mililitros. Luego, agregue 0.5 mililitros de cloroformo en el vial. Pipetee 7.2 mililitros de aceite de silicona y 1.8 mililitros de aceite mineral en un tubo separado de 15 mililitros y mezcle los aceites vórtice a una velocidad de 3, 200 rotaciones por minuto durante 10 segundos.
Luego, agregue la mezcla de aceite al vial que contiene la mezcla de lípidos y cloroformo y vórtice la mezcla a la velocidad de 3, 200 rotaciones por minuto durante 10 a 15 segundos hasta que la mezcla resultante de lípidos en aceite esté ligeramente turbia, ya que los lípidos no se disuelven completamente en el aceite. A continuación, sonice el lípido en la dispersión del aceite en un sonicador de baño con potencia ultrasónica de 80 vatios y una frecuencia de funcionamiento de 40 kilohercios durante 30 minutos a temperatura ambiente. Si no se usa inmediatamente, guarde la mezcla de lípidos y aceite a cuatro grados Celsius durante 24 horas.
Para generar las vesículas, use el conjunto con un eje impreso en 3D hecho de resina negra montado en la placa de agitación de sobremesa a la velocidad de 1, 200 rotaciones por minuto. Luego, monte la encapsulación de cruce de interfaz de gota continua impresa en 3D, o cámara cDICE, hecha de resina transparente en el eje de resina negra. Prepare una solución de actina de 1 a 10 micromolares en tampón de actina globular, o tampón G, incluida la actina ATO 488 al 10%.
Para comenzar la polimerización de actina, agregue un tampón de polimerización de actina filamentosa, o tampón F, en una solución de actina sobre hielo y luego mantenga las soluciones en hielo para ralentizar la polimerización de actina antes de agregar un reticulador. Para preparar las proteínas de unión a actina, o ABP, a partir de 1,75 miligramos por mililitro de stock de fascin, alícuota 1,57 microlitros de fascin en un microtubo separado. A continuación, agregue un 7,5% de medio de gradiente de densidad en la solución de actina para crear un gradiente de densidad entre la fase acuosa externa e interna y facilitar la sedimentación de vesículas unilamelares gigantes o GUV.
Luego, dispense 700 microlitros de glucosa 200 milimolares como solución externa en la cámara. Agregue suficiente mezcla de lípidos y aceite en la cámara hasta que se llene del 60% al 80% de la cámara. Se formará una interfaz entre la mezcla de lípidos y aceite y la solución externa.
Prepare una mezcla de actina-ABP transfiriendo ABP a la solución de actina. Luego, use una pipeta regular de 100 a 1, 000 microlitros para transferir los 700 microlitros de la mezcla de lípidos y aceite a la mezcla de actina-ABP. Pipete hacia arriba y hacia abajo ocho veces para generar gotas de emulsión monocapa lipídica del tamaño de una célula con un diámetro de 7 a 100 micras.
Use la misma pipeta de 100 a 1, 000 microlitros para dispensar toda la emulsión en la cámara giratoria. Las gotas adquirirán una segunda valva de lípidos cruzando la monocapa lipídica en la interfaz aceite-solución externa, formando así GUVs. Cuando haya terminado, retire la cámara de la placa de agitación y deseche la mayor parte de la mezcla de lípidos y aceite inclinando la cámara en el contenedor de residuos.
Al sostener la cámara con la tapa hacia el interior, abra la tapa de la cámara e incline ligeramente la cámara hacia adentro. La interfaz entre la solución externa que contiene GUV y la mezcla de lípidos y aceite será visible desde la abertura de la cámara donde se encuentra la tapa. Use una pipeta para recolectar suficiente solución externa que contenga GUV y dispense de 50 a 300 microlitros de la solución externa en una placa de 96 pocillos para obtener una densidad adecuada de GUV.
Para obtener imágenes de los GUV, configure la placa de 96 pocillos en el escenario de un microscopio invertido equipado con una lente de objetivo de inmersión en aceite 60X. Abra una secuencia de imágenes de interés en un software de procesamiento de imágenes, ImageJ Fiji, e identifique la imagen con la mayor intensidad. Mantenga presionada la tecla Control Mayús C para abrir la ventana de brillo y contraste y haga clic en la pestaña de reinicio.
En el menú ImageJ Fiji, vaya a las pestañas Analizar y Establecer escala para ingresar la distancia física conocida y la unidad para cada píxel de imagen. Una vez hecho esto, vaya a los botones Imagen, Pilas y luego Proyecto 3D para reconstruir una imagen 3D de la pila Z. Establezca el método de proyección como Punto de brillo, Espaciado de corte como 0,5 micrómetros y, a continuación, marque la casilla Interpolar.
Utilice las opciones predeterminadas para el resto de la configuración y capture imágenes. La imagen representativa muestra una imagen confocal de GUV marcados con rodamina PE con haces encapsulados de fascin-actina. La transferencia de las proteínas de unión a la actina a la solución de actina, luego la adición de la mezcla de lípidos y aceite y la generación de gotas monocapa lipídicas deben tener lugar en unos pocos segundos para evitar la formación de redes de actina antes de la encapsulación.
Hemos utilizado esta técnica cDICE modificada para examinar los roles de los diferentes enlaces cruzados de la red de actina en la organización de las redes de actinas. Esperamos que este método ayude a otros investigadores a explorar la regulación de otras proteínas del citoesqueleto.
