El protocolo propone el uso del gusano del tabaco como un sistema modelo de insectos para estudios preclínicos de cannabinoides. Este sistema permite a los investigadores investigar fácilmente las respuestas agudas y a largo plazo a los cannabinoides. El sistema modelo de insectos permite a los investigadores investigar los efectos terapéuticos de los cannabinoides en una gran población dentro de tres a cuatro semanas con menos mano de obra y costos que otros sistemas animales.
Obtener de 150 a 200 huevos M.sexta viables y dietas artificiales a base de germen de trigo. Coloque los huevos del gusano del cuerno en una placa de Petri de poliestireno con una capa de dieta artificial a base de germen de trigo y transfiera los huevos a una cámara de cría de insectos mantenida a 25 grados centígrados con una humedad relativa del 40 al 60%. Deje que los huevos eclosionen durante uno a tres días dentro de la cámara de cría de insectos.
Para preparar una solución madre de cannabidiol de 200 milimolares, agregue 1,26 gramos de aislado de cannabidiol de mayor al 98% de pureza en 20 mililitros de etanol o aceite de triglicéridos de cadena media al 100%. Agregue cinco mililitros y 10 mililitros de la solución madre de cannabidiol de 200 milimolares a los 1,000 gramos de una dieta artificial para un milimolar y dos milimolares de cannabidiol, respectivamente. Dispense 20 gramos de vehículo de control y medios que contengan cannabidiol en la parte inferior del tubo de 50 mililitros.
Distribuya aleatoriamente aproximadamente dos larvas de instar de aproximadamente dos milímetros de largo individualmente en un tubo de ensayo de 50 mililitros y cúbralas con una tapa perforada o una gasa. Cultivarlos dentro de una cámara de cría de insectos mantenida a 25 grados centígrados con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Para medir el crecimiento larvario, registre la masa y el tamaño iniciales de cada grupo con una balanza analítica y una regla, respectivamente, e introduzca las larvas en sus respectivas dietas.
Reste la masa de las larvas en cada medición a intervalos de dos días de la masa inicial para determinar las ganancias de masa entre las etapas de desarrollo de las larvas. Además, registre el número de días entre las etapas de desarrollo de instar para comprender las diferencias en el marco de tiempo de desarrollo hasta la pupación. Para medir el consumo de dieta, registre los gramos iniciales de dieta al comienzo del experimento y éstelos de la cantidad restante de dieta cuando las larvas entraron en la etapa de pupación completa.
Para la medición de la movilidad larvaria, permita que el insecto sometido se aclimate a la cámara de acondicionamiento del miedo durante al menos cinco minutos y rastree las distancias que los tres grupos de insectos del quinto instar viajaron durante cinco minutos. Luego, ejecute el software de detección de movimiento para analizar la respuesta de movilidad. Los insectos criados con una dieta artificial mostraron el mejor rendimiento de crecimiento.
El control del vehículo que utilizó aceite de triglicéridos de cadena media al 0,1% como agente disolvente para el aislado de CBD también mostró un crecimiento normal sin ningún efecto perjudicial. Sin embargo, una dosis alta de CBD de dos milímetros indujo la pérdida de peso y condujo a una tasa de mortalidad más alta que los grupos de control y vehículos. Las larvas de M.sexta criadas con AD con un milímetro de CBD consumieron al menos 3,1 veces más dieta que las criadas con una dieta de etanol añadido.
Sin embargo, el consumo de dieta de los insectos criados en dos medios milimolares añadidos con CBD no fue significativamente diferente de las larvas criadas en dietas de solo etanol. El índice móvil de la larva de M.sexta criada en diferentes condiciones muestra que el 1% de etanol y una larva milimolar tratadas con CBD no afectaron la movilidad. Los tratamientos con etanol al 2% resultaron ser letales.
La adición de una alta dosis de CBD en AD que contiene 2% de etanol restauró la baja movilidad. Una vez que se agrega CBD a las dietas, homogeneice completamente la mezcla de CBD de la dieta y cultive insectos en la cámara de cría de insectos mantenida a 25 grados centígrados con 40 a 60% de humedad para evitar un brote de hongos. Las respuestas electrofisiológicas también se pueden monitorear con los ganglios de la cadena ventral diseccionados de Manduca sexta para determinar si el CBD afecta el sistema nervioso central del gusano del tabaco.
El sistema modelo de insectos permitirá a los investigadores explorar las funciones farmacéuticas de otros cannabinoides mayores y menores mediante pruebas a lo largo de múltiples generaciones, lo que permitirá un diseño experimental en mamíferos superiores.
