El ensayo de alimentación de microplacas proporciona un método simple, económico y de alto rendimiento para medir el comportamiento de alimentación de Drosophila, y ofrece múltiples ventajas sobre otros métodos más elaborados. La cuantificación del consumo midiendo la absorbancia con un lector de placas elimina las mediciones manuales y evita la entrada manual de datos. Los datos también son susceptibles de extracción y procesamiento programático.
Con este ensayo de alto rendimiento podemos cuantificar el consumo de nutrientes solubles en agua, medicamentos, productos farmacéuticos o toxinas, y el sistema puede modificarse para aplicaciones a una variedad de especies de insectos. Comience vertiendo la agarosa fundida en un canal de reactivos y dispense 80 microlitros de agarosa fundida en cada pozo de una microplaca de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Refrigere la agarosa sobrante hasta por una semana en una bolsa sellada y vuelva a fundirla para hacer platos adicionales.
Si las tiras de barrera están demasiado sueltas, enrollarlas alrededor del dedo para darles curvatura para mantenerlas en los canales. Inserte las tiras de barrera en los canales de la tira de barrera para preparar los acopladores. Coloque el acoplador en una placa de inanición, asegurándose de no usar el acoplador para manipular la placa, ya que el acoplador puede deslizarse.
Asegúrese de que la esquina en ángulo del acoplador coincida con la esquina en ángulo de la microplaca para mantener la orientación correcta. Bajo anestesia de CO2, clasque las moscas de tres a cinco días de edad. Cargue moscas individuales por columna en la placa de inanición.
Cierre cada columna a medida que se llena ajustando su tira de barrera a la posición cerrada. Registre cuidadosamente el diseño de la muestra dentro de la microplaca. Una vez que se llena la placa de inanición, permita que las moscas se recuperen espontáneamente después de eliminar el CO2 y las muere de hambre durante seis horas a partir de su tiempo de anestesia inicial.
Prepare 10 mililitros de alimento líquido en un tubo cónico de 15 mililitros disolviendo 0,4 gramos de sacarosa y 0,1 gramos de extracto de levadura en 10 mililitros de agua destilada. Vórtice el tubo hasta que los sólidos se disuelvan por completo. Agregue 40 microlitros de solución de caldo de colorante y transfiera el alimento líquido a una jeringa de 10 mililitros con una punta de filtro de 0,45 micrómetros.
Filtre aproximadamente 1,5 mililitros de la solución a la vez en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Deje a un lado la jeringa que contiene la solución y filtre la solución adicional según sea necesario durante la preparación de la placa de alimentación. Prepare una placa alimentadora sellando el fondo de una microplaca de 1536 pozos con una película de sellado.
Use una paleta de sellado para adherirse a la película a fondo. Luego, recorte el exceso de película de los bordes izquierdo y derecho con una cuchilla de afeitar. Dispense 10 microlitros de la columna de alimentos líquidos filtrados en el pozo superior izquierdo para cada grupo de cuatro pozos de la microplaca de 1536 pozos.
Una vez que todos los pozos estén llenos, aplique una película de sellado en la parte superior de la placa, siguiendo los mismos pasos utilizados para sellar la parte inferior de la microplaca. Repita para el número deseado de placas. Centrifugar las placas a 200 veces G durante 10 segundos para asentar el fluido.
No permita que la placa se enfríe, ya que esto puede hacer que se acumule condensación en los pozos, oscureciendo las lecturas de absorbancia. Perforar los pozos en la superficie superior de la placa con la herramienta de sonda de aguja equipada con una aguja de 0,25 milímetros de diámetro, utilizando el mismo orden de perforación que se utilizó al dispensar las soluciones. Limpie la aguja entre las soluciones para evitar la contaminación cruzada.
Voltee la placa y perfore los pozos en la parte inferior. Lea la absorbancia de la placa a 630 nanómetros sin tapa. Coloque una tapa interna en la película de sellado superior para asegurarse de que los anillos de condensación rodeen los pozos perforados, luego coloque la tapa externa en la placa.
Coloque la placa de alimentación boca arriba en el acoplador de modo que las guías alineen los orificios apropiados de la placa de alimentación y la placa de inanición. Asegúrese de que el acoplador y las placas estén correctamente orientados. Una vez que todas las placas de alimentación estén cargadas en los acopladores, abra los pozos para las placas ajustando las tiras de barrera en el acoplador.
Coloque el acoplador y los conjuntos de placas en el recipiente secundario. Coloque la mitad inferior de una caja de pipetas que contenga toallas de papel empapadas en cada recipiente secundario para proporcionar humedad. Cierre la tapa del recipiente secundario y transfiéralo a un entorno controlado.
Deje que las moscas consuman durante 22 horas. Después de las 22 horas de exposición, verifique cada placa en busca de moscas muertas y actualice el diseño de la placa en consecuencia. Después de revisar todas las placas, anestesia las moscas en masa bombeando CO2 dentro del contenedor secundario.
Después de aproximadamente 60 segundos, asegúrese de que todas las moscas estén inmovilizadas. Golpee suavemente las moscas en la placa de inanición y reemplace las tiras de barrera de plástico. Retire las placas de alimentación para su lectura.
Relea la absorbancia de la placa a 630 nanómetros. Repita el proceso hasta que se hayan leído todas las placas. La evaporación se cuantificó para cada pozo y se encontró que determina si existen correlaciones entre los pozos de placas individuales.
Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para la evaporación versus filas y la evaporación versus columnas para evaluar las tendencias entre la evaporación y la ubicación de los pozos. El consumo de moscas Canton-SB de tres a cinco días de edad se cuantificó para establecer la validez del protocolo. A las moscas se les dio a elegir entre una solución de sacarosa al 4% con extracto de levadura al 1% y una solución de sacarosa al 4% suplementada con etanol al 15% y extracto de levadura al 1%.
Tanto los machos como las hembras mostraron una preferencia abrumadora por la solución con etanol y extracto de levadura. Es esencial mantener la consistencia al construir las placas alimentadoras, asegurando que cada mosca se presente con un escenario de consumo idéntico en lo que respecta al volumen, la evaporación y el acceso a los alimentos. Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de Drosophila realizar ensayos de alto rendimiento para comportamientos de consumo y preferencia con mayor rendimiento y a menor costo en comparación con los métodos tradicionales.
