Este protocolo demuestra la nueva separación de macrófagos cardíacos medios y el trasplante en ratones adultos, lo que podría ser una forma permisiva de promover la reparación cardíaca. Las implicaciones de esta técnica se pueden extender al campo de regeneración cardíaca. Comience por preenfriatar la plataforma operativa de bronce durante la noche a 20 grados centígrados.
Saque el ratón anestesiado de la nevera y colóquelo en la plataforma. Anclar el ratón en posición supina con cinta adhesiva médica. Coloque la plataforma operativa con el mouse debajo de un estereoscopio y desinfecte el pecho del mouse con una almohadilla de preparación empapada con betadina y alcohol al 70%.
Incise la piel con un corte de un centímetro en la cuarta área intercostal de la cavidad torácica, y separe los músculos intercostales usando tijeras microquirúrgicas hasta acceder al corazón. Alternativamente, presione el pecho y el abdomen con la ayuda de dos forrceps hasta que el corazón se exteriorice fuera del pecho sin ningún daño mecánico. Coloca las costillas por debajo y por encima de la pequeña incisión como una fijación natural para inmovilizar el corazón, localizar el ápice del ventrículo izquierdo y cortar un milímetro de diámetro de tejido del ápice ventricular con las tijeras de iridectomía.
Confirme que la cámara ventricular izquierda está expuesta y comienza a supurar. Presione suavemente el corazón de nuevo en la cavidad torácica con un hisopo de algodón, suture los músculos, las costillas y la piel con suturas de proleno de ocho por cero y limpie el ratón a fondo después de la operación. Transfiera el ratón de la plataforma operativa a una manta calefactora de 37 grados para calentar el cuerpo inmediatamente después de la operación.
Confirme la antibiosis del ratón observando los signos de restauración espontánea de la respiración, el cambio de color de la piel de pálido a rosa y el movimiento de las extremidades. Lleve el ratón operado de vuelta a su madre una vez que se haya recuperado. Mezcle el ratón operado y los materiales de anidación de su madre, si es necesario.
Cosechar el corazón de un ratón CX3-CR1-GFP neonatal sacrificado un día después de la resección apical y sumergirlo en un plato de 10 centímetros con PBS. Corte los vasos y el tejido conectivo restante lejos de los ventrículos. Cortar el apéndice auricular y el tracto de salida lejos del corazón.
Después de que el corazón deje de latir, corte el corazón en una o dos piezas de milímetros cúbicos en tampón salino de fosfato usando tijeras microquirúrgicas. Transfiéralos a un tubo que contenga 2,5 mililitros de mezcla de enzimas precalentadas y cierre bien el tubo. Invierta el tubo y colóquelo con la tapa hacia abajo, luego ejecute el programa de disociación cardíaca neonatal.
Separe el tubo del disociador después de que se complete el programa. Agregue 7.5 mililitros de 1x DMEM con 10% FBS al tubo. Filtre y transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Centrifugar la suspensión celular a 300 veces G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de solución de lisis de células sanguíneas e incube durante dos minutos a temperatura ambiente. Agregue de 5 a 10 mililitros de tampón salino de fosfato a la suspensión y centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos.
Vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de DMEM con 10% fbS, luego clascriba los macrófagos cardíacos neonatales GFP positivos por fax. Clasifica los macrófagos en un tubo estéril que contiene 500 mililitros de DMEM con 10% FBS. Contar los macrófagos GFP positivos y volver a suspenderlos en DMEM con 10% FBS a la concentración de un millón de macrófagos por 200 mililitros de DMEM para su posterior inyección.
Se inyectaron macrófagos cardíacos neonatales en el corazón de ratón adulto infarto de miocardio y la eficacia de los cardiomiocitos proliferativos se confirmó mediante tinción inmunofluorescente. El análisis estadístico muestra que la proliferación de cardiomiocitos aumenta después del trasplante de macrófagos. Las imágenes del ecocardiograma muestran la función cardíaca en un ratón adulto un mes después del infarto de miocardio.
La función cardíaca se mejora después del trasplante de macrófagos. La masa en la tinción muestra que el área infartada en un ratón adulto un mes después del infarto de miocardio se redujo notablemente después del trasplante de macrófagos cardíacos neonatales. El trasplante de macrófagos cardíacos neonatales podría ser una estrategia de promoción para promover la regeneración del corazón bucal adulto.
Este protocolo ayuda a los investigadores a perseguir el desarrollo de aplicaciones regenerativas y explorar el mecanismo de regeneración cardíaca.
