Aquí, demostramos el método Updegraff, el método más utilizado del mundo para la estimación del contenido de celulosa cristalina. La celulosa se compone básicamente de monómeros de glucosa vinculados por enlaces beta-1, 4 glicosidos. Dividimos este protocolo en cinco fases.
En la primera fase, preparamos el material de biomasa vegetal. En la segunda fase, extraemos la pared de la célula cruda. En la tercera fase, utilizamos el tratamiento updegraff en el que Updegraff se compone de ácido acético y ácido nítrico que ayuda en la eliminación de hemicelulosa y lignina de nuestras muestras.
En la cuarta fase, lo sometemos a hidrólisis ácida con la ayuda de ácido sulfúrico que produce los monómeros de glucosa. Finalmente, en la quinta fase, utilizamos ensayos de antrones para estimar el contenido cristalino de celulosa. Recoger el material vegetal del invernadero, lavarlos a fondo con agua, secar al aire durante dos días, separar el tejido y transferir el tejido a los recipientes etiquetados individualmente e incubar en la incubadora a 49 grados centígrados durante 10 días.
A continuación, corte en pedazos con tijeras o cuchilla. Congele el tejido y cargue en mortero y pestle para moler finamente en polvo uniforme o, alternativamente, utilice congelador/molino. Aquí, demostramos el uso de congelador / molino, por lo que cargamos nuestras muestras de tejido en estos viales de molienda y las colocamos en el congelador / molino y ejecutar la velocidad de 10 CP durante tres ciclos.
El polvo de tejido se recoge en el tubo Falcon como se muestra aquí. Pesar 20 mg del tejido en polvo y transferir en un tubo de dos ml prepesado. Añadir un ml de tampón de solubilización proteica para eliminar las proteínas. vórtice.
Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante. Repita este paso dos veces más.
Añadir un ml de agua estéril al pellet retenido. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Repita este paso dos veces más.
Agregue un ML de 70% de etanol al pellet retenido. vórtice. Transfiéralo a un bloque precalentado de 70 grados centígrados con agitación simultánea durante una hora. Después de una hora de incubación, centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos.
Repita este paso una vez más. Al pellet salvado, añadir un mL de 100% metillona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos.
Añadir un ml de metanol cloroformo. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue un ml de acetona. vórtice.
Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Vuelva a desechar el sobrenadante y seque al aire a 37 grados centígrados durante la noche o continúe secando al vacío.
Cargue sus muestras en el secador de vacío y seque al aire durante dos o tres horas o hasta que el pellet esté completamente seco. Pesar cinco mg del extracto de pared celular obtenido del paso anterior. Transfiéralo a un tubo de tapa de tornillo de dos ml.
También incluya un control positivo en este punto. Utilice dos mg de papel filtrante Whatman para ese propósito. Transfiéralo a un tubo de tapa de tornillo de dos ml.
Agregue 1,5 ml de reactivo Updegraff a cada extracto de pared celular pesada. Vórtice e incubar a 100 grados centígrados en un bloque precalentado durante 30 minutos. Después de 30 minutos de incubación, transfiéralo a un estante.
Deje que se enfríe en el banco durante 10 minutos. Centrífuga a 15.000 RPM durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante sin molestar al pellet.
Agregue un ml de agua estéril. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante 10 minutos. Deseche 500 microlitros del sobrenadante.
Añadir un ml de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche un ml del sobrenadante.
Añadir un ml de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante por completo.
Añadir un ml de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante.
Secar a 37 grados centígrados durante la noche. Después de una incubación de una noche, transfiéralo a un estante. Añadir un ml de ácido sulfúrico al 67%. vórtice.
Incuba a 25 grados centígrados durante una hora con temblores simultáneos. Después de una hora de incubación, asegúrese de que el pellet esté completamente disuelto. Transfiéralo a un estante.
Este es el paso final de la extracción de celulosa. Ahora las muestras están listas para la dilución de la muestra. Para la dilución de muestras, utilice 10 microlitros de cada muestra del paso anterior y agregue 490 microlitros de agua estéril.
Repita esto para todas las muestras experimentales. Para la preparación de curva estándar de glucosa, preparar un caldo fresco de un mg por ml de glucosa y preparar cero microgramos a 200 microgramos concentraciones mediante la adición de un mg por ml de glucosa en 20 incrementos de microlitro y hacer el volumen final a un mL con agua estéril. Tome 500 microlitros de cada estándar preparado en un tubo de tapa de tornillo y agregue un mL 0.2% de antronérona.
Y ahora las muestras están listas para el ensayo de antrones. Agregue un ml de antronérona recién preparada. Mezcle inmediatamente con el vórtice y transfiéralo al hielo.
Repita para todos los estándares y muestras de la misma manera. A continuación, transfiéralo a un bloque precalentado de 100 grados centígrados durante 10 minutos. Después de 10 minutos de incubación, transfiéralo al hielo e incuba durante cinco minutos sobre hielo.
Después de la incubación, tome 200 microlitros de cada muestra en tres réplicas. Repita tanto para estándares como para muestras de la misma manera. Y una placa cargada de 96 pozos fue cargada en un detector multimodo.
Con el programa Smart Max Pro, establecemos la configuración del filtro en 620 nanómetros. Tipo de placa a tipo de 96 pozos. Seleccione toda el área de lectura.
Haga clic en Aceptar. leer. Lea la placa. Obtendrá las lecturas de absorbancia de estándares y muestras, que se recopilarán en la hoja de Excel para su posterior análisis y estimación del contenido de celulosa.
La curva estándar de glucosa se prepara utilizando las concentraciones de glucosa en microgramos por ml en el eje X y los valores de absorbancia normalizados de la concentración respectiva a 620 nanómetros en el eje y. Obtenemos la línea de regresión con valores m y c en el gráfico de dispersión trazado que usamos para estimar el contenido de celulosa cristalina de muestra. En el primer paso, promediamos los valores de OD en 620 nanómetros.
Y luego normalizamos los datos restando el valor en blanco. Calculamos que la concentración de glucosa utilizando la fórmula x es igual a OD menos c/m donde conectamos valores c y m del paso anterior de la línea de regresión en la curva estándar. Dado que el volumen total que se utilizó para el ensayo de antrones es de 500 microlitros, lo dividimos por el factor dos de dilución.
Dado que el volumen de la muestra que se utilizó fue de sólo 10 microlitros, dividiremos aún más por 10 para obtener microgramos por concentración de microlitro de glucosa que es igual a mg por concentración de ml. Y luego usamos el factor de humedad 1.11 que es la ganancia de humedad en el proceso. Y finalmente, calculamos el porcentaje de contenido de celulosa cristalina dividiéndolo con el peso de la pared celular, que está cerca de cinco mg, y multiplicar por 100 para obtener el porcentaje.
Luego promediamos el contenido de celulosa cristalina de tres réplicas biológicas para obtener el valor de las muestras individuales, que se compararán con otro promedio de línea experimental de tres réplicas biológicas. Y la prueba t se puede utilizar para probar su nivel de importancia. Aquí, en la tabla A, mostramos los valores de tabla de la concentración y el OD respectivo en 620 nanómetros, que se utilizó aún más para trazar un gráfico de dispersión y una línea de regresión con los valores m y c que se utilizaron en la C para obtener las diferencias de contenido de celulosa entre las dos líneas experimentales.
En conclusión, ambas muestras muestran diferencias de celulosa. Gracias por mirar.
