Este protocolo permite la adquisición simultánea de varios embriones dentro de una sesión de imágenes. Mientras que la preparación de muestras está adaptada para la adquisición de múltiples puntos utilizando un analizador de alto contenido, las muestras preparadas con este protocolo se pueden tomar imágenes en cualquier microscopio invertido capaz de adquirir varios puntos. Para empezar, organice dos filas de 15 a 20 embriones en una sección limpia de gran plato utilizando una herramienta de recolector de óvulos.
Alinee los embriones en su lado ventral en la misma orientación con respecto a los extremos anterior y posterior. Adherir un espaciador en un cubreobjetos y rayar 10 microlitros de pegamento de heptano por el inserto de vidrio de cubrelip expuesto. Mientras el pegamento se seca, usa una cuchilla de afeitar para cortar un rectángulo alrededor de las dos filas de embriones.
Corte un segundo rectángulo junto al primero y retire el segundo rectángulo con un borde recto de una espátula de acero inoxidable. Deslice cuidadosamente el borde recto de la espátula debajo del primer rectángulo y retírelo. A continuación, coloque el recorte con embriones en el lado externo de una placa de 3,5 centímetros.
Bajo un microscopio estéreo, baje un cubreobjetos preparado sobre los embriones y presione suavemente las dos filas de embriones sobre el pegamento. Si no realiza la microinyección, llene el espaciador de silicona hasta la parte superior con aceite de halocarbono uno a uno 700 al aceite de halocarbono 27. Forte los bordes inferiores de un adaptador de placa de cuatro diapositivas con cinta adhesiva de doble cara.
Esto evitará que la diapositiva se mueva durante la toma de imágenes. Asegúrese de no colocar la cinta en la ruta del objetivo. Monte el cubreobjetos en el adaptador de placa de cuatro deslizamientos.
Si microinyecía los embriones, coloque el cubreobjetos con embriones sobre una diapositiva para evitar que la parte inferior del cubreobjeto se ensucie durante la desicación y la microinyección. Deseque los embriones durante cinco a 10 minutos, luego cúbralos inmediatamente con aceite de halocarbono uno a uno 700 al aceite de halocarbono 27, llenando el espaciador de silicona hasta la parte superior. Cargue dos o tres agujas de microinyección con aproximadamente dos microlitros de inyector utilizando una punta de carga extendida.
Monte una aguja en el microinyector y presione el émbolo hasta la punta, aumentando la presión de aire dentro del capilar de vidrio. Baje la aguja de vidrio en un portaobjetos de vidrio y corte la punta de la aguja con una nueva maquinilla de afeitar número nueve, cortando en un ángulo de 45 grados para producir una punta abierta afilada. El inyector debe fluir hasta la parte inferior de la punta sin salir de la aguja.
Agregue cuidadosamente 20 microlitros de aceite de halocarbono sobre la punta de la aguja y vuelva a cortarlo abierto en un ángulo de 45 grados. El inyector debe comenzar a fluir rápidamente, así que recuerde ajustar la presión retrayendo el émbolo. Utilice el micromaniprógrafo para colocar la aguja en el centro del campo de visión.
A continuación, levante la aguja y retire el portaobjetos de vidrio de debajo de ella. Coloque los embriones en la etapa del microscopio estéreo, debajo de la aguja de microinyección y concéntrese en ellos a 50 veces el aumento. Baje la aguja hasta que entre en el mismo plano de enfoque que los embriones.
Mover la diapositiva con una mano y operar el microinyector con la otra, inyectar una fila de embriones. Levante la aguja y gire el portaobjetos 180 grados para exponer la segunda fila de embriones a la aguja de microinyección. Baje la aguja e inyecte la segunda fila de embriones.
Este protocolo se utilizó para examinar el papel de los microtúbulos en la reorganización del retículo endoplasmático durante la mitosis en el embrión de Drosophila. Los efectos de varios tratamientos farmacológicos microinyecitos en la reorganización de urgencias se compararon cuantitativamente. Se encontró que la colchicina, que previene la polimerización de nuevos microtúbulos, reduce drásticamente la localización de la sala de emergencias a los polos de husillo durante la mitosis.
Se adquirieron datos de imágenes de lapso de tiempo para 32 embriones. Se analizaron mediciones de intensidad media y máxima a partir de 12.800 regiones de interés utilizando un script MATLAB personalizado. Al intentar este protocolo por primera vez, recuerde no tomar demasiado tiempo en un solo paso, de lo contrario corre el riesgo de perder su etapa de desarrollo que desea imaginar.
Practique este protocolo paso a paso antes de realizar cualquier experimento. Nuestro método de preparación de muestras facilita la adquisición simultánea de múltiples embriones durante un experimento, generando así suficientes réplicas experimentales para el análisis cuantitativo. Este protocolo puede ayudar a la transición de la embriología del desarrollo de experimentos de imagen cualitativos a cuantitativos.
La capacidad de imaginar varios embriones dentro de una sesión de imágenes también elimina el ruido experimental entre réplicas.
