Los autores reconocen con gratitud el trabajo de Liuliu Zheng y Zenghui Xue, que ayudaron a ser pioneros en esta técnica en el laboratorio Sokac, así como de Hasan Seede, quien ayudó con el análisis. El trabajo para este estudio está financiado por una subvención de NIH (R01 GM115111).

<ol>
	<li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos.">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li><li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/cofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion.">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li><li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies.">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li><li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. 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R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress.">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li><li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells.">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li><li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin.">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li><li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein,+cofilin.">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li><li>Minamide, L. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology.">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li><li>Mollinari, C., Gonz&#225;lez, A., Cid-Arregui, A., Garc&#237;a-Carranc&#225;, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+and+transgenesis.">Microinjection and transgenesis.</a> Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. , 587-603 (1998).</li><li>Figard, L., Sokac, A. 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(49), 2503 (2011).</li><li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , (2018).</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li><li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster.">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li><li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing.">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li></ol>

No se declaran conflictos de intereses.

La importancia de este método es que utiliza el protocolo bien establecido de microinyección en embriones de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 para permitir nuevas investigaciones sobre el ASR y el conjunto de barras actin acompañantes. Una ventaja importante de inyectar G-actinRojo en embriones vivos es que el ASR se puede estudiar bajo una variedad de contextos. Para futuros estudios, estos contextos pueden incluir inyectar embriones de otros genotipos como parte de una pantalla mutante o exponer embriones inyectados a diferentes condiciones de estrés, como el estrés oxidativo4,32. Aunque no se describe en detalle aquí, esta técnica de inyección también se puede modificar para inyectar ácidos nucleicos, otras proteínas, fármacos y tintes indicadores (por ejemplo, ver21,22,23,24,32)para estudiar el ASR. Por lo tanto, este método presenta una serie de enfoques para identificar el rango de tensiones que inducen el ASR, caracterizando aún más las respuestas celulares durante el ASR (por ejemplo, cambios en la actividad mitocondrial), y descubriendo nuevas moléculas y mecanismos subyacentes al conjunto de barras de actina intranuclear.
Algunos pasos críticos del protocolo incluyen los siguientes: En el paso 3.8, los embriones deben desecados adecuadamente para garantizar una inyección exitosa y la mejor salud de los embriones. El tiempo de desecación dependerá de la temperatura ambiente y la humedad del laboratorio, por lo que se recomienda practicar primero el montaje, la desecación y las inyecciones con un búfer de pH neutro para establecer este parámetro para el manejo de los embriones. En el paso 4.5, los ajustes de microneedle e inyección deben ajustarse para permitir la inyección de suficiente G-actinRojo en embriones. Si se inyecta muy pocorojo G-actin en el embrión, las barras de actina pueden no visualizarse fácilmente, ya que la formación de varillas de actina depende de la concentración de actina libre1. Además, será difícil obtener resultados consistentes de los experimentos frap si no hay suficiente G-actinrojo inyectado, ya que la intensidad de fluorescencia no será lo suficientemente alta como para superar la fluorescencia de fondo. Por lo tanto, es importante calibrar el tamaño de la burbuja cada vez que se carga y utiliza una aguja nueva. G-actinRed es viscoso y tiende a obstruir dentro del microagleo. A veces, esto puede conducir a inyectar cantidades variables de G-actin en los embriones. Si el microagleo está obstruido y la limpieza del microagle con alta presión falla, puede ser necesario intentar romper la punta del microagleo aún más o incluso cargar un nuevo microagle e inyectar un nuevo conjunto de embriones. Por último, en el paso 4.11, los embriones deben ser incubados a temperatura elevada y durante el tiempo suficiente para que el ASR sea inducido y las varillas formen1. Las temperaturas de todas las incubadoras deben controlarse constantemente, el tiempo de transferencia de embriones de incubadora a incubadora debe ser limitado y se debe utilizar un temporizador para todas las incubaciones. Otros posibles problemas se enumeran en la Tabla 2 con consejos de solución de problemas que acompañan.
Una limitación importante de este protocolo es que se debe tener un cuidado excepcional para preservar la salud de los embriones durante las inyecciones, incubaciones e imágenes. El protocolo ha sido diseñado para maximizar la salud de los embriones, y con una práctica significativa, un investigador puede completar todos los pasos del protocolo con el desarrollo del embrión progresando a las tasas esperadas por temperatura31. Una segunda limitación del protocolo es la necesidad de un equipo de microinjección, que puede ser bastante caro y no es un equipo común para cada laboratorio de moscas. Sin embargo, si un laboratorio adyacente está equipado para inyectar otros embriones (por ejemplo, Xenopus,Pez Cebra y Caenorhabditis elegans)o células adherentes, el equipo de inyección utilizado es probablemente adecuado para inyecciones de Drosophila. En ese caso, sólo la forma de la aguja debe adaptarse para los embriones de Drosophila de acuerdo con las directrices del Pipette Cookbook29. Alternativamente, hay algunas opciones de micoinjector menos costosos en el mercado (por ejemplo, microinyectores analógicos), lo que puede reducir significativamente el costo de montar un equipo de inyección.

Este protocolo describe cómo inyectar G-actinRojo para visualizar el montaje de barras de actina intranuclear en embriones estresados por calor que están siendo sometidos a una respuesta inducible a la tensión actin (ASR)1. Desarrollamos este protocolo para ayudar a los estudios del ASR, que en embriones conduce a morfosis interrumpida y viabilidad reducida, y en adultos los tipos de células humanas se asocian con patologías como insuficiencia renal2,miopías musculares3,y la enfermedad de Alzheimer y Huntington4,5,6,7,8. Este ASR es inducido por numerosas tensiones celulares, incluyendo choque de calor9,10,11,estrés oxidativo4,6,síntesis ATP reducida12,y huntingtina anormal u oligomerización amiloide β4,5,6,7,9,13,14,15,16. Un sello distintivo del ASR es el montaje de varillas de actina aberrantes en el citoplasma o núcleo de las células afectadas, que es impulsado por la hiperactivación inducida por el estrés de una proteína que interactúa con actina, Cofilina1,5,6,10. Lamentablemente, siguen existiendo lagunas clave en el conocimiento con respecto al ASR. Por ejemplo, se desconoce la función de las varillas actin. No entendemos por qué se forman varillas en el citoplasma de algunos tipos de células, pero el núcleo de otros. Tampoco está claro si el ASR es protector o maladaptivo para las células o embriones sometidos a estrés. Por último, todavía no conocemos los mecanismos detallados subyacentes a la hiperactivación de cofilina o el conjunto de varillas actin. Por lo tanto, este protocolo proporciona un ensayo rápido y versátil para sondear el ASR visualizando la formación de varillas actin y dinámicas en el sistema experimental altamente tractable del embrión de mosca de la fruta viva.
El protocolo para microinyecto G-actinRed en embriones drosophila vivos fue desarrollado inicialmente para estudiar la dinámica de las estructuras normales de actina citoplasmática17 durante eventos de construcción de tejidos. En esos estudios, encontramos que la inyecciónroja de G-actin no afectaba negativamente a los procesos de desarrollo tempranos en el embrión, incluida la citoquinasis o la gastrulación17,18. A continuación, modificamos el protocolo, adaptando el manejo del embrión y la inyección de G-actinrojo para permitir la toma de imágenes de barras de actina en embriones estresados por calor sometidos al ASR1. Otros métodos además de la inyección de G-actinrojo se pueden utilizar para visualizar actina en embriones. Estos métodos se basan en la expresión de proteínas fluorescentes (FPs) etiquetadas para actuar o a dominios de proteínas de unión a la actina, como Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP y Moesin-GFP (revisada en19). Sin embargo, el uso de estas sondas FP requiere precaución porque pueden estabilizar o interrumpir algunas estructuras de actina, no etiquetar por igual todas las estructuras de actina20, y en el caso de actin-GFP, son altamente sobreexpresados – problemático para el análisis del conjunto de varillas que no sólo depende del estrés, sino también actuar en la concentración dependiente1. Por lo tanto, G-actinRed es la sonda preferida para estudios de varilla en embriones de mosca, y el gran tamaño del embrión permite su fácil inyección.
El flujo de trabajo de este protocolo es similar a otras técnicas de microinjeción bien establecidas que se han utilizado para inyectar proteínas, ácidos nucleicos, fármacos e indicadores fluorescentes en embriones de Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. Sin embargo, después de la microinyección de G-actinRed aquí, los embriones están expuestos a estrés por calor leve para inducir el ASR y el conjunto de varilla de actina intranuclear. Para laboratorios con acceso a moscas y un equipo de inyección, este método debe ser fácilmente implementable y adaptable para líneas de estudio específicas con respecto a la ASR, incluyendo su inducción por diferentes tensiones o modulación en distintos antecedentes genéticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A23835G</td>
			<td style="width:299px;">Component of G buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Apple juice, Mott&#39;s, 64 fl oz</td>
			<td style="width:195px;">Mott&#39;s</td>
			<td style="width:121px;">014800000344</td>
			<td>Component of apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">214010</td>
			<td>Component of apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:195px;">KIK International</td>
			<td style="width:121px;">059647210020</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C1016500G</td>
			<td>Component of G buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell strainer, 70 &#956;m</td>
			<td style="width:195px;">Falcon</td>
			<td style="width:121px;">352350</td>
			<td>For collecting dechorionated embryos</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">0000001994956</td>
			<td>For imaging intranuclear actin rods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Desiccant</td>
			<td style="width:195px;">Drierite</td>
			<td style="width:121px;">24001</td>
			<td>For desiccating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4350649000000</td>
			<td>For arranging embryos on agar wedge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dissecting needle, 5 in</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">08965A</td>
			<td>For arranging embryos on agar wedge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">BP1725</td>
			<td>Component of G buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in</td>
			<td style="width:195px;">3M</td>
			<td>021200010323</td>
			<td>For making embryo glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Embryo collection cage</td>
			<td style="width:195px;">Genessee Scientific</td>
			<td style="width:121px;">59100</td>
			<td>For housing adult flies and collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">72701D</td>
			<td>For arranging embryos on agar wedge</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm</td>
			<td style="width:195px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW1004</td>
			<td>For microneedles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Halocarbon oil 27</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H8773100ML</td>
			<td>For hydration of embryos</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:223px;">Heated stage incubator</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:223px;">Lab Tissue Wipers, KimWipes</td>
			<td style="width:195px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:121px;">34155</td>
			<td>Lab tissue wipers</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">Discontinued</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Methyl-4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H36471KG</td>
			<td>Component of apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microinjector, FemtoJet4x</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td>5253000025</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 &#956;L</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:121px;">5242956003</td>
			<td>For loading microneedles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment</td>
			<td style="width:195px;">Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td>
			<td style="width:121px;">Custom</td>
			<td>For performing microinjections</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:121px;">P97</td>
			<td>For pulling capillary tubes to make microneedles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Microscope cover glass 24x50-1.5</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">12544E</td>
			<td>For mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">22037081</td>
			<td>For mounting embryos for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">n-Heptane</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">H3601</td>
			<td>Component of embryo glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Objective, 10x</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">Discontinued</td>
			<td>10x objective for injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4217679971711</td>
			<td>40x water objective for confocal</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:223px;">Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4208529871000</td>
			<td>25x mixed immersion objective for confocal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:121px;">4207829900799</td>
			<td>63x oil objective for confocal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2</td>
			<td style="width:195px;">Daler-Rowney</td>
			<td style="width:121px;">038372016954</td>
			<td>For transferring embryos</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white</td>
			<td style="width:195px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:121px;">884266344845</td>
			<td>For blotting cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pasteur pipette, 5 3/4 in</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1367820A</td>
			<td>For covering embryos with oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Petri dish, glass, 100 x 20 mm</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">3160102</td>
			<td>For humid incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Petri dish, plastic, 60 x 15 mm</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">25384092</td>
			<td>For apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 &#956;L</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:121px;">2231000604</td>
			<td>For loading the microneedle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pipette tip, xTIP4 250 &#956;L</td>
			<td style="width:195px;">Biotix</td>
			<td style="width:121px;">63300006</td>
			<td>For adding embryo glue to coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Razor blade</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">55411050</td>
			<td>For cutting agar wedge, tape, pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 &#956;g)</td>
			<td style="width:195px;">Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">APHR-A</td>
			<td>G-actin^Red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">033377</td>
			<td>For making embryo glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Screw top jar, 16 oz</td>
			<td style="width:195px;">Nalgene</td>
			<td style="width:121px;">000194414195</td>
			<td>For desiccating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Stage micrometer</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">602104PG</td>
			<td>For calibrating volume of G-actin injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Sucrose</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">840971KG</td>
			<td>Component of apple juice plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Trizma base</td>
			<td style="width:195px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T15031KG</td>
			<td>Component of G buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:223px;">Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz</td>
			<td style="width:195px;">Lesaffre Yeast Corporation</td>
			<td style="width:121px;">117929157002</td>
			<td>Component of yeast paste</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos

El propósito de este protocolo es visualizar varillas de actina intranuclear que se ensamblan en embriones drosophila melanogaster vivos después del estrés térmico. Las barras actin son un sello distintivo de una respuesta al estrés actin (ASR) conservada e inducible que acompaña a las patologías humanas, incluida la enfermedad neurodegenerativa. Anteriormente, demostramos que el ASR contribuye a fallos de morfosis y a una menor viabilidad del desarrollo de embriones. Este protocolo permite el estudio continuo de los mecanismos subyacentes al montaje de varillas actin y el ASR en un sistema modelo que es altamente apto para la creación de imágenes, genética y bioquímica. Los embriones se recogen y montan en una cubierta para prepararlos para la inyección. La actina globulaular conjugada con rhodamina (G-actinrojo)se diluye y se carga en un microneedle. Se realiza una sola inyección en el centro de cada embrión. Después de la inyección, los embriones se incuban a temperatura elevada y las barras de actina intranuclear se visualizan mediante microscopía confocal. La recuperación de fluorescencia después de los experimentos de fotobleaching (FRAP) se puede realizar en las barras actin; y otras estructuras ricas en actina en el citoplasma también se pueden imaginar. Encontramos que G-actinRed polimeriza como G-actin endógeno y no interfiere, por sí solo, con el desarrollo normal de embriones. Una limitación de este protocolo es que se debe tener cuidado durante la inyección para evitar lesiones graves en el embrión. Sin embargo, con la práctica, inyectar G-actinrojo en embriones de Drosophila es una manera rápida y confiable de visualizar varillas de actina y se puede utilizar fácilmente con moscas de cualquier genotipo o con la introducción de otras tensiones celulares, incluyendo hipoxia y estrés oxidativo.

Un flujo de trabajo esquemático de manejo de embriones se representa en la Figura 1y se presenta un calendario para un experimento típico en la Tabla 1. Una estimación para un buen resultado experimental es que por cada 10 embriones inyectados, al menos la mitad de los embriones vistos estarán en la etapa de desarrollo correcta, sin daños, y exhibirán un ASR robusto con estrés térmico a 32 °C. Este ASR será evidenciado por el montaje de varillas de actina intranuclear como se muestra en la imagen representativa de vista superficial de un embrión en la Figura 2A (panel derecho). Las varillas actin aparecerán en varias orientaciones (paralelas o perpendiculares al plano de imágenes) dentro de los núcleos y se pueden tomar imágenes a través de varios planos focales. En comparación, los embriones de control incubados a 18 °C no mostrarán varillas actin(Figura 2A,panel izquierdo). El porcentaje de núcleos que contienen varillas se puede cuantificar, como se muestra en la Figura 2B. Además, se pueden realizar experimentos FRAP en varillas(Figura 2C). En la Figura 2Dse hace referencia a un método de cuantificación sugerido para los datos FRAP y se muestra un ejemplo de una gráfica de recuperación de fluorescencia para una región blanqueada frente a una región no manipulada de una varilla actin.
Si un embrión está gravemente dañado por inyección o se vuelve demasiado seco durante el experimento, se puede observar la asincrasia mitotica y se interrumpirá la celularización. A veces, es posible que las varillas no sean visibles debido a que no se inyecta suficiente actina en el embrión. Si esto sucede, asegúrese de que la cantidad de G-actinrojo inyectado es de 500 pL (medido con un micrómetro en el paso 4.5) y confirme que esta cantidad sigue siendo consistente entre embriones haciendo una inyección de prueba en el aceite circundante para comprobar el tamaño de la burbujaroja de G-actin entre cada microinyección embrionaria. Además, para garantizar la visualización de la varilla, trabaje rápidamente para añadir el control de cubiertas y mover los embriones a la etapa de microscopio calentado una vez que se toman de la cámara húmeda en el paso 5.4, ya que el montaje de la varilla es reversible1 y las varillas pueden desmontarse si los embriones se mantienen a una temperatura inferior a 32 °C durante más de 30 minutos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61297/61297fig1.jpg"> Figura 1: Visión general esquemática del manejo de embriones durante el experimento. (1) Las moscas adultas en las tazas de recolección de embriones ponen embriones en las placas de agar de jugo de manzana. (2) Los embriones son desoconsejados con 1:1 lejía: agua destilada, vertida en una cesta de recolección y lavada a fondo con agua destilada para eliminar lejía y escombros. (3) Los embriones se transfieren con un pincel a una cuña de agar de jugo de manzana rectangular en un tobogán y dispuestos en sus lados, cara a cara, con región dorsal orientada al borde del agar. (4) Una región de 5 x 50 mm de un tubo de vidrio (naranja) está recubierta con "pegamento embrionario" y presionada suavemente sobre la fila de embriones dispuestos en el agar para adherirlos a la mancha. (5) Se invierte el encubridores con embriones para que los embriones se enfrenten. Los embriones se desecan en un frasco de tornillo. (6) Inmediatamente después de la desecación, la mancha de cubierta se pega a un tobogán, embriones mirando hacia arriba, y los embriones están cubiertos con aceite de Halocarbono 27. (7) Un microneedle previamente cargado conrojo G-actin preparado se utiliza para realizar una sola inyección en el centro de la región ventral de cada embrión, con aguja colocada paralela al deslizamiento de cubierta. (8) Después de la inyección, los embriones se incuban dentro de una placa De Petri humidificada con limpiaparabrisas de tejido de laboratorio húmedos a temperatura de control (18 °C) o con estrés por calor (32 °C). (9) Después de la incubación, el cubrebotas con los embriones en él se elimina de la diapositiva. (10) Dos trozos de cinta a doble cara están en capas uno encima del otro, cortados por la mitad a lo largo, y colocados a ambos lados del aceite que rodea a los embriones en el primer punto de cubierta. Un segundo coverlip (azul) se coloca en la parte superior de la primera para crear una nueva superficie de imágenes, offset para que deje un hueco para que se agregue más aceite para cubrir los embriones según sea necesario. (11) Si se toma imágenes en un microscopio confocal invertido, el sándwich de coverslip se invierte para que el segundo coverslip se enfrente al objetivo. Las imágenes se realizan en una cámara incubada, y las barras de actina se visualizan en varios planos focales de los núcleos de cada embrión. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61297/61297fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61297/61297fig2.jpg"> Figura 2: Resultados representativos de las barras de actina en embriones estresados por el calor. (A) Las varillas actin no se ven en un embrión que fue incubado a una temperatura de control de 18 °C (panel izquierdo), pero se ven en los núcleos de un embrión que estaba estresado térmicamente a 32 °C (panel derecho). B) Cuantificación del porcentaje de núcleos con barras de actina de un experimento representativo. Cada punto representa un embrión donde se contaron varillas y núcleos en toda la región de imágenes (n = 22 embriones a 18 °C; n = 23 embriones a 32 °C; las barras de error muestran desviación estándar). La prueba t de un estudiante, con una variación desigual asumida, se utilizó para calcular el valor p. (C) Una serie temporal representativa muestra FRAP en una barra actin. La parte de la varilla que fue blanqueada está indicada por una punta de flecha blanca. La pre-lejía es de 2 s antes del paso de la lejía. Tiempo = 0 s es el paso de la lejía, y la recuperación de fluorescencia fue rastreada hasta 60 s después de la lejía. (D) Una parcela muestra dinámicas de recuperación para la fluorescencia actin en una región blanqueada de una varilla, en comparación con una región intachable en la misma varilla. Las varillas son notablemente estables y actuar dentro de ellas no tiene rotación. Por lo tanto, no se ve ninguna recuperación. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61297/61297fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cuadro 1: Flujo de trabajo experimental con horario sugerido. Este calendario resume el tiempo previsto que se tardará en completar cada paso del protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Orden</td>
			<td>Paso</td>
			<td>Tiempo necesario para cada paso</td>
			<td>Descripción</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>5 días de antelación</td>
			<td>Hacer jaulas de recolección de embriones. Vierta los platos del agar de jugo de manzana.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.2-1.3</td>
			<td>2 días de antelación</td>
			<td>Instala jaulas de colección con moscas machos y hembras adultas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Nota 2.6</td>
			<td>1 día de antelación</td>
			<td>Tire de tubos capilares para hacer microneedles.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>2.1-2.6</td>
			<td>1 h</td>
			<td>Prepara a G-actin.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>3.1</td>
			<td>30 min</td>
			<td>Deje que las moscas den huevos.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>3.2-3.10</td>
			<td>15-30 min</td>
			<td>Recoger, montar, desecar embriones. Cubra embriones con aceite.</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4.1</td>
			<td>30 minutos de antelación</td>
			<td>Preparar cámaras de incubación húmedas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>4.2-4.4</td>
			<td>1 min</td>
			<td>Cargue microneedle.</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>4.5-4.10</td>
			<td>10-20 min</td>
			<td>Calibrar el tamaño de la burbuja G-actin e inyectar embriones.</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>4.11</td>
			<td>30 min-1+ h</td>
			<td>Incubar embriones de estrés térmico/ incubar.</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>5.1-5.3</td>
			<td>1 h de antelación</td>
			<td>Encienda el microscopio y la etapa de incubación.</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>5.4-5.10</td>
			<td>5 min</td>
			<td>Sandwich embriones entre coverslips para imágenes.</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>5.11-6.6</td>
			<td>15 min-1+ h</td>
			<td>Imagen de barras de actina intranuclear en embriones.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Sugerencias de solución de problemas. Esta tabla proporciona sugerencias para solucionar problemas para ayudar a completar correctamente el protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Problema potencial</td>
			<td>Sugerencias</td>
		</tr>
<tr>
<td>Las moscas no ponen suficientes embriones.</td>
			<td>Configure la taza con al menos 5 días de antelación (consulte los pasos 1.1-1.3). Cambie las placas 3 veces al día antes del experimento para fomentar la puesta de huevos. Deje que las moscas dejen los embriones durante 1 h en lugar de 30 min. Prepara tazas con moscas adultas jóvenes.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ninguna G-actin es expulsada de la microneedle.</td>
			<td>Aumente la presión y la configuración de tiempo en el microinyector. Rompa aún más la punta del microneedle (consulte el paso 4.5 Nota). Dado que es posible que los obstrucciones importantes no se despejen, cargue una aguja nueva.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difícil calibrar un tamaño de burbuja lo suficientemente pequeño.</td>
			<td>Ajuste los ajustes de presión y hora (consulte el paso 4.5). Dado que la abertura de la punta del microneedle puede ser demasiado grande, cargue una aguja nueva.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Los embriones se liberan del pegamento en la cubierta durante la inyección.</td>
			<td>Ajuste la consistencia del "pegamento embrionario" para futuros puntos de cubierta añadiendo más cinta de doble cara a la solución de heptano (consulte el paso 3.5 Nota).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Embriones se secan durante la incubación de temperatura.</td>
			<td>Asegúrese de que la diapositiva esté nivelada en la cámara de incubación (consulte el paso 4.11) y de que el aceite no esté tocando nada que pueda desviarlo. Añadir gotas adicionales de aceite a los embriones. Disminuya el tiempo de desecación previa a la inyección (consulte el paso 3.8).</td>
		</tr>
<tr>
<td>El aceite no cubre completamente los embriones entre la primera y la segunda mancha.</td>
			<td>Añadir aceite adicional a través de la acción capilar a la pequeña brecha entre las cubiertas (consulte el paso 5.8 Nota).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Las varillas de actina intranuclear no son visibles en embriones estresados por el calor.</td>
			<td>Inyecte un volumen mayor de G-actin (consulte el paso 4.5). Confirme que la temperatura tanto de la incubación posterior a la inyección (consulte el paso 4.11) como de la cámara de imágenes es de 32 °C (consulte el paso 5.3).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grandes burbujas de G-actin son visibles alrededor del lugar de inyección de embriones.</td>
			<td>Inyecte un volumen más pequeño de G-actin (consulte el paso 4.5). Aumentar el tiempo de desecación del embrión para promover una mejor retención de la actina inyectada dentro del embrión (consulte el paso 3.8).</td>
		</tr>
</tbody></table>

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Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

El objetivo de este protocolo es inyectar actina globular conjugada con rhodamina en embriones de Drosophila y el conjunto de barras de actina intranuclear de imagen después del estrés térmico.

Imágenes Intranuclear Actin Rods en vivo calor estresado Drosophila Embriones

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

3.4K vistas.  Baylor College of Medicine. El objetivo de este protocolo es inyectar actina globular conjugada con rhodamina en embriones de Drosophila y el conjunto de barras de actina intranuclear de imagen después del estrés térmico.

Video: Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Métodos para el pH intracelular de la proyección de imagen del linaje de la célula de vástago del folículo en vivo tejido ovárico de Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagen en vivo y análisis de contracciones musculares en Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...