El uso de la expresión tisular específica del reportero fluorescente de poliglutamina en C.elegans es significativo porque permite el descubrimiento y la caracterización de reguladores de la proteostasis en el contexto de un organismo multicelular intacto. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización y cuantificación de la disminución asociada a la edad en la proteostasis celular in vivo, lo cual es esencial para obtener una visión mecanicista más profunda de cómo los organismos mantienen el plegamiento y la función adecuados del proteoma y los efectos del envejecimiento. Elucidar mecanismos capaces de preservar la proteostasis facilitará el desarrollo de intervenciones dirigidas para el tratamiento de enfermedades asociadas al envejecimiento en las que la proteostasis está comprometida y para promover un envejecimiento saludable.
El colapso de la proteostasis es un problema clínico masivo, ya que subyace al desarrollo de enfermedades de plegamiento erróneo de proteínas, como el Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica. Comience usando placas de Petri de 6 centímetros de diámetro para preparar cinco placas de agar para cada condición de prueba. Para experimentos con RNAi, inducir la producción de dsRNA en HT115 E. coli transformada y usar agar RNAi.
Utilice OP50 E.coli en el agar NGM estándar para experimentos sin ARNi. Cultive los cultivos de E. coli durante la noche a 37 grados Celsius mientras tiembla a 220 RPM. Al día siguiente, peletizar las bacterias por centrifugación a 2, 400 G durante 15 a 20 minutos, luego aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en una décima parte del volumen inicial de lb.
Alícuota 200 microlitros de bacterias concentradas en cada placa y permita que las placas abiertas se sequen en un ambiente limpio hasta que todo el líquido haya sido absorbido. Para sincronizar los C.Elegans con el tratamiento con hipoclorito, lave los hermafroditas grávidos dos veces con tampón M9, luego transfiéralos a un tubo fresco e incube en 5 mililitros de solución de hipoclorito durante cinco minutos, sacudiéndolos cada minuto. Después de la incubación, gire hacia abajo a los animales y lávelos tres veces con el tampón M9.
Permita que los embriones eclosionen en tubos durante la noche en 3 mililitros de solución M9 con rotación a 20 grados centígrados. Calcule la densidad de los animales L1 dejando caer 10 microlitros de solución L1 tres veces sobre una placa de 6 centímetros y contando el número de animales L1. Periódicamente, mezcle las soluciones L1 para evitar que los animales se asienten.
Sembr 50 L1 un animal en cada placa, contar y registrar el número de semillas, y mover las placas a una incubadora de 20 grados Centígrados. Alternativamente, para sincronizar a los animales a través de la puesta de huevos, coloque de cinco a diez animales adultos jóvenes y grávidos en cada plato durante cuatro a seis horas y permítales poner huevos hasta que haya aproximadamente 50 huevos por plato. Retire todos los adultos grávidos y mueva las placas con los huevos a una incubadora de 20 grados centígrados.
Cultive los animales hasta la etapa L4, que tomará aproximadamente 40 horas a 20 grados centígrados. Luego agregue 50 microlitros de 160 veces FUDR. Para medir la disminución de la proteostasis en el tejido muscular, elija 20 animales y móntelos en un portaobjetos de microscopio con una almohadilla de agarosa al 3% y una gota de 5 microlitros de azida de sodio de 10 milimolares.
Después de que todos los gusanos estén inmovilizados, imagine todo el cuerpo de los animales usando una lente de aumento de 10 X. Use un filtro FITC o YFP y la misma exposición para cada animal. Cuando haya terminado, deseche las diapositivas.
Cuente el número de focos en los músculos de la pared del cuerpo de todo el animal. Los focos son señales puntuadas más brillantes que se pueden diferenciar de la señal soluble de atenuación en el fondo. En los días de puntuación, mire las placas con los animales y registre el número de animales paralizados, luego retire los animales paralizados de la placa.
Al finalizar el experimento, calcule la tasa de parálisis para cada afección y trace la progresión de la parálisis. Para medir la disminución de la proteostasis en el tejido neuronal, monte los gusanos en una diapositiva como se describió anteriormente y tome imágenes de la pila Z de la cabeza de los animales en un microscopio compuesto utilizando una lente de aumento de 40 X. Deseche las diapositivas después de la obtención de imágenes.
Después de adquirir las imágenes, aplana las pilas Z y utilíceslas para cuantificar el número de focos en las neuronas ubicadas en el área del anillo nervioso. Trazar la progresión de la acumulación de focos de YFP desde los días 4, 6, 8 y 10. En el segundo día de la edad adulta, recoja 10 animales sincronizados de la placa y colóquelos en una gota de 10 microlitros de tampón M9 en un portaobjetos de microscopio.
Repita este paso al menos cuatro veces para obtener una muestra de 40 o más animales. Grabe en video el movimiento de los animales durante un período de 30 segundos en un microscopio estéreo con una cámara con capacidad de video. Una vez grabados todos los vídeos con los animales a analizar, reproduce el vídeo y puntúa las curvas corporales de cada animal.
Traza el número de curvas del cuerpo para cada animal en un gráfico de columnas, donde cada punto representa el número de curvas del cuerpo en 30 segundos en el eje Y y las diferentes condiciones probadas en el eje X. El modelo de repetición de poliglutamina ha sido fundamental para la identificación de genes que regulan la red proteostática. La expresión de poliQ-YFP específica del músculo da como resultado la acumulación de focos fluorescentes que son fáciles de cuantificar bajo un microscopio de disección fluorescente simple.
Los animales se paralizan durante la mediana edad, ya que el proteoma dentro del músculo colapsa debido al efecto proteotóxico del reportero. La disminución asociada a la edad en la proteostasis neuronal puede ser seguida por la cuantificación directa de la formación de agregados y la disminución en las curvas coordinadas del cuerpo después de colocar a los animales en líquido. Este método se ha utilizado para demostrar que la proteína quinasa que interactúa con el dominio homeo, un cofactor transcripcional, influye en la proteostasis durante el envejecimiento mediante la regulación de la expresión de la autofagia y las chaperonas moleculares.
La pérdida de HPK-1 aumenta el número de agregados Q35-YFP que se acumulan durante el envejecimiento. Los animales de control mostraron un promedio de 18 agregados, mientras que los animales tratados con hpk1 null mutant y HPK1 RNAi mostraron un promedio de 28 y 26 agregados, respectivamente. Para el octavo día de la edad adulta, del 77 al 78% de los animales deficientes en HPK1 estaban paralizados, en comparación con solo el 50% del control.
Además, se demostró que la sobreexpresión de HPK1 regula la formación de agregados de proteínas y protege a los animales envejecidos de la parálisis asociada a Q35-YFP durante el envejecimiento. Este método mide la disminución general del proteoma dentro de un tipo de célula. Existen muchos métodos para evaluar los cambios en componentes específicos de la red prostática.
Juntos, proporcionan una imagen completa. La disminución de la proteostasis es un sello distintivo del envejecimiento. Este enfoque permite a los investigadores cuantificar esta disminución.
Cuando se combina con el análisis genético, es una herramienta poderosa para el descubrimiento.
