El montaje eficiente de estructuras supramoleculares para un diseño celular mínimo y la administración de medicamentos sigue siendo un desafío. Aquí, demostramos protocolos eficientes que producen estructuras supramoleculares basadas en proteínas anfifílicas similares a la elastina. Los protocolos de montaje presentados generan estructuras supramoleculares versátiles con propiedades fisicoquímicas adaptables, como vesículas, fibras y coacervados.
Los compartimentos basados en membranas proteicas demuestran el comportamiento de separación de fases y permiten la encapsulación de moléculas de carga fluorescentes químicamente diversas. Para la expresión de F20E20-mEGFP y F20E20-mCherry, inocule la principal cultura de expresión de la precultura nocturna a una OD600 de 0.3. Incubar en 400 mililitros de medio LB estéril complementado con antibióticos apropiados a 37 grados Celsius y 200 rpm.
Cuando el cultivo de expresión alcance OD600 de 0,5 a 0,8, añada IPTG a una concentración final de un milimolar y reduzca la temperatura de incubación a 20 grados centígrados. Para la expresión de ELP anfifílico con el aminoácido antinatural, inocular la principal cultura de expresión de E.coli preculcionado nocturno que contiene los plásmidos apropiados a una D.O. de 0.3. Incubar en 400 mililitros de medio LB estéril suplementado con kanamicina y cloramphenicol a 37 grados Celsius y 200 rpm.
Para preparar el stock de aminoácidos antinaturales de 100 mililitros, agregue 206,2 miligramos de aminoácido no natural a ocho mililitros de agua ultrapura. Elevar el pH de la solución con hidróxido de sodio de tres molares y mezclar vigorosamente. Cuando el aminoácido no natural se disuelva, baje el pH a aproximadamente 10,5, y agregue agua ultrapura a un volumen de 10 mililitros.
Filtre la solución con un filtro estéril de 0,22 micrómetros y aliquotáquela en tubos de reacción de dos mililitros. Cuando el cultivo de expresión alcance OD600 de 0,5 a 0,8, agregue el aminoácido antinatural a una concentración final de dos milimolar. Incubarlo durante 10 minutos más.
A continuación, inducir la expresión de la proteína diana y la synthetasa tRNA necesaria a través de la adición simultánea de IPTG y arabinosa. Reduzca la temperatura de incubación a 20 grados centígrados y permita que la expresión continúe durante aproximadamente 20 horas. Después de la incubación, cosechar las células por centrifugación a cuatro grados celsius y 4.000 veces g durante 40 minutos.
Resuspender el pellet celular en tampón de lelisis con lesozima y PMSF. Incubar la solución durante 30 minutos sobre hielo. A continuación, congele y descongele dos veces sumergiendo en nitrógeno líquido.
Sonicar la suspensión, y limpiar el izado por centrifugación a 10.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 40 minutos. A continuación, purificar la proteína mediante cromatografía de afinidad. Después de la elución de proteína, guárdela a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior.
Agregue un microlitro de tinte fluorescente a 500 microlitros de solución ELP, e incubar la reacción durante unas 10 horas a 15 grados Centígrados mientras agita en un ThermoMixer, asegurándose de protegerlo de la luz. Para eliminar el exceso de colorante fluorescente, equilibre una membrana de diálisis en agua ultrapura durante 10 minutos. Corte la membrana en el tamaño correcto para colocarla en la parte superior de la abertura del tubo de reacción con la solución ELP clicada.
A continuación, fije la membrana a la abertura cerrando el tubo con una tapa que no tiene núcleo. Llene el espacio entre la tapa y la membrana con tampón para evitar la captura de aire. A continuación, coloque el tubo de reacción en el búfer elegido, empújelo por debajo de la superficie y déjelo al revés.
Realice diálisis durante al menos tres horas a cuatro grados centígrados, lo que permite que la diálisis continúe durante al menos tres horas más después de cada cambio de búfer. Para la hinchazón THF, dializar la solución ELP homogénea contra el fosfato o tampón Tris con pH estable 7.5. Prepare el liofilizador y enfríelo a la temperatura de inicio para el secado por congelación.
Aliquot la solución de proteína dializada en tubos de reacción de 1,5 mililitros, y sellar con tapas con un pequeño agujero para evitar la pérdida de la muestra sólida debido a cambios de presión en el curso de la congelación. Congele las muestras en nitrógeno líquido. Saque las muestras de proteína congeladas del nitrógeno líquido e inmediatamente colóquelas en el liofilizador para comenzar a secarlacándose.
Después de que la muestra esté completamente seca, ventilarla con nitrógeno seco e inmediatamente cerrar las tapas del tubo de reacción para evitar el contacto con la humedad del aire. Agregue THF puro a las muestras liofilizadas y coloque la solución en un sonicador de baño de agua con agua helada durante 15 minutos. Precalienta un termociclador a 30 a 60 grados Celsius para la formación de vesículas o hasta 90 grados Celsius para la formación de fibra, y prepara nuevos tubos de reacción con agua ultrapura o tampón.
Después de la sonicación, coloque la solución ELP/THF y el agua o tampón preparado en el termociclador durante cinco minutos. A continuación, estratifique la solución ELP en la parte superior del agua o tampón, asegurándose de que la separación de las dos fases y una interfase distinta es visible, y coloque la mezcla de nuevo en el termociclador. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 10 minutos, y proceda con diálisis contra agua o tampón o con microscopía de fluorescencia.
Prepare una solución ELP de uno a 50 micromolares y agregue de 10 a 20%1-butanol. Mezcle inmediatamente la solución en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. La turbidez de la solución debe aumentar durante la mezcla, lo que indica la formación de vesículas.
Para lograr una distribución de tamaño estrecho, extruya las vesículas con un mini extrusor a través de una membrana con un tamaño de poro de un micrómetro. Para la encapsulación de colorante, mezcle aproximadamente 40 microlitros de solución ELP en Tris-HCl de 10 mililitros con un microlitro de la solución de stock Dextran Texas Red en DMSO. Agregue 10 microlitros de 1 butanol y extruya de cinco a 10 veces a través de una jeringa equipada con una aguja de 0,25 por 25 milímetros.
El método de hinchazón THF se compone de tres pasos sucesivos y da como resultado diferentes conjuntos supramoleculares de la ELP dependiendo de la temperatura. Las imágenes de microscopía de epifluorescencia muestran vesículas ensambladas a partir de BDP-R20F20 y estructuras fibrilarias ensambladas a partir de BDP-R40F20. El método de extrusión de 1 butanol conduce exclusivamente a la formación de vesículas ELP.
Alrededor de dos órdenes de magnitud más vesículas se producen en comparación con el método de hinchazón THF. BDP-R40F20 se mezcló con 10 a 15% de butanol, y las vesículas se prepararon a través de la extrusión de la mezcla. Se montaron diferentes estructuras supramoleculares a partir de BDP-R40F20 a través del protocolo de hinchazón THF.
El pH del tampón y la temperatura del proceso de montaje se ajustaron para formar coacervados, fibrillas o vesículas. Pequeños errores en el protocolo de montaje pueden conducir a la formación de agregados. El tinte cargado positivamente ATTO Rho 13 y el dextrán rojo polisacárido dextrán se encapsularon en el lumen de las vesículas ensambladas a partir de F20R20-mEGFP a través del método de extrusión de 1 butanol.
Las imágenes de microscopía confocal muestran las vesículas en el canal verde, la carga en el canal rojo y la encapsulación exitosa en el canal combinado resultante. También se demostró el comportamiento de separación de fase y fusión de los anfifílicos ELP tras la mezcla de bloques de construcción de PMBC únicos frente a las poblaciones de PMBC ensambladas. La mezcla antes del montaje de PMBC conduce a moléculas distribuidas homogéneamente dentro de la membrana PMBC ensamblada, mientras que la mezcla de las poblaciones de vesículas ensambladas conduce a parches de membrana de fluorescencia roja o verde que son visibles durante al menos 20 minutos.
Al intentar este procedimiento, es importante prestar atención al orden de paso correcto y a las diferencias entre el método de hinchazón THF y el método de extrusión de butanol. Siguiendo este protocolo, las vesículas ELP se pueden utilizar como lanzaderas de entrega de fármacos, como plataforma para reacciones enzimáticas, como transcripción y traducción in vitro, o en la formación de células mínimas sintéticas.
