Este protocolo es adecuado para el estudio de la virulencia de Leishmania, ya que proporciona una visión sistémica del huésped de los vertebrados a la infección cutánea. La principal ventaja de adoptar este protocolo es que permite a los investigadores evaluar simultáneamente la respuesta inflamatoria del huésped y la replicación del parásito. Este método se puede utilizar para caracterizar varios objetivos y tratamientos relacionados con la virulencia, lo que podría aportar nuevos conocimientos sobre el control de la leishmaniasis cutánea.
También se puede aplicar a otras cepas de ratones y especies de Leishmania que causan leishmaniasis cutánea. Este ensayo tiene algunos pasos críticos, como requerir personal capacitado que se sienta cómodo trabajando con ratones y tenga experiencia en la realización de inyecciones subplantares para evitar la exposición accidental a material infeccioso. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Ricardo Zampieri, un técnico de mi laboratorio.
Comience por el cultivo de promastigotes L.amazonensis en un matraz de cultivo celular cuadrado de 25 centímetros, que contiene 10 mililitros de pro-medio, durante tres días a 25 grados celsius. Después de la incubación, pipetear cinco mililitros de cultivo promastigoto de fase de crecimiento logarítmico en un nuevo matraz. Añadir cinco mililitros de ama-medio al matraz, e incubarlo a 34 grados centígrados durante tres a cuatro días.
Dividir el cultivo diluyéndolo en una proporción de uno a tres con ama-medio fresco en un nuevo matraz. Luego incubar durante otros tres a cinco días. Transfiera una alícuota de la suspensión de amastigonos especrénicos diluidos en PBS a una cámara Neubauer y cuente los parásitos no flagelados.
A continuación, diluir la suspensión en PBS de acuerdo con la dosis de inóculo deseada y el número de inóculos previstos. Cargue una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 27 con la suspensión del parásito preparada. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado con un pellizco del dedo del pie e inocular 50 microlitros de la suspensión en el tejido subplantar en el reposapiés trasero izquierdo.
Registre la progresión de la lesión una vez a la semana, midiendo el grosor de las almohadillas infectadas y no infectadas utilizando una pinza, y calcule la diferencia de espesor entre las dos almohadillas para evaluar la progresión de la lesión. Añadir un mililitro de pro-medio en un tubo de molienda de tejido de vidrio por lesión y pesar el tubo. Rocíe 70% de etanol en la almohadilla para la desinfección e excite el pie del animal en su talón para extraer la almohadilla de pie infectada.
Asegúrese de que las tijeras y fórceps estén esterilizados manteniéndolos empapados en 70% de etanol. Coloque el reposapiés en un plato estéril de Petri y disectándolo con los fórceps y el bisturí. Recoger todo el tejido blando y desechar los huesos.
Transfiera los tejidos recogidos al tubo de molienda de tejido de vidrio y cargue el tubo de nuevo para determinar el peso de la lesión. Homogeneizar el tejido 10 veces con la amoladora para una interrupción completa del tejido, y permitir que la mezcla se atase. Recoger 20 microlitros del sobrenadante y cargarlo en la primera columna y primer carril de la placa de 96 pozos, preparado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Repita este paso para que los siguientes tres carriles tengan resultados cuadrúplicados para cada animal. Homogeneizar cada pozo 10 veces con una pipeta multicanal, y transferir 20 microlitros de la muestra diluida de la primera a la segunda columna. Continúe la dilución en serie hasta que se alcance la última columna y deseche los 20 microlitros finales de la muestra diluida.
Selle la placa con película e i incuba a 25 grados centígrados durante siete días en una cámara húmeda. Después de la incubación, analice la placa bajo un microscopio invertido para determinar el último pozo que contiene parásitos para cada carril. Los parásitos protozoarios de leishmania existen en dos formas de desarrollo durante su ciclo de vida en huéspedes invertebrados y vertebrados: promastigotes y amastigotes.
Las condiciones esxenicas pueden simular diferentes ambientes de host in vitro, manteniendo la morfología y viabilidad del parásito. Las condiciones esxenicas para los amastigoados imitan el ambiente ácido y el aumento de la temperatura de los huéspedes vertebrados. Los promastigotes se diferenciarán en amastigotes en estas condiciones.
Cuando se transfieren a pH neutro y se incuban a 25 grados centígrados, los amastigotes esxenicos se transforman de nuevo en promastigotes. La diferencia de virulencia de tipo salvaje y leishmania Iron Regulator 1 knockout cepas se observó en las almohadillas de ratón infectados. LIR1 regula los niveles de hierro intracelular en Leishmania, mediando la exportación de hierro y evitando su acumulación intracelular a niveles tóxicos.
El ensayo de infección que incluye la diferencia en la hinchazón y la progresión de la lesión reveló que LIR1 es esencial para la virulencia in vivo de L.amazonensis. La carga del parásito se determinó mediante la realización de un ensayo de dilución limitante a partir de las lesiones infectadas. Las lesiones de los ratones infectados por nocaut LIR1 contienen de 10 a seis parásitos menos que las de los ratones infectados de tipo salvaje Leishmania, revelando que la ausencia de LIR1 previene la replicación intracelular de los amastigotes.
Una de las cosas más importantes a recordar cuando usted está realizando este procedimiento es utilizar culturas de Leishmania que fueron alabadas in vitro menos de diez veces para evitar la pérdida de virulencia del parásito. Además de este procedimiento, podría utilizar ensayos de infección in vitro. Sin embargo, este es un método limitado, porque no proporciona una visión fisiológica sistémica de la interacción huésped-parásito.
Este método in vivo es el mejor enfoque para evaluar las respuestas sistémicas para la leishmaniasis cutánea, como la cuantificación de biomarcadores séricos en los tejidos huésped recuperados para estudios inmunológicos adicionales.
