La privación visual monocular es un excelente protocolo experimental para inducir plasticidad de respuesta cortical visual primaria. Normalmente, las neuronas en el segmento binocular de la corteza visual primaria en el ratón responden aproximadamente dos veces más fuertemente a la estimulación del ojo contralateral que al ojo ipsilateral. Sin embargo, la sutura de cerrar el ojo contralateral durante el período crítico de plasticidad de dominancia ocular resulta en la rápida pérdida de capacidad de respuesta por parte de las neuronas V1 a la estimulación ocular contralateral y también seguido de un aumento posterior en la respuesta al ojo ipsilateral.
Aquí, introducimos el protocolo experimental para la privación monocular y para sugerir un método comúnmente utilizado para analizar la tendencia en el dominio ocular durante la privación visual. Coloque las herramientas quirúrgicas en una caja de aluminio y autoclavelas por debajo de 120 grados centígrados durante media hora. Preparar una solución de 2% de agarosa en la tetera de agua y mantenerla a 75 grados centígrados.
Aplica una fina capa de pomada ocular en ambos ojos. Bajo el microscopio anatómico con iluminación, suturar los párpados. Haz unos cuatro puntos.
Haga de dos a tres nodos del subproceso. Aplicar tres microlitros de pegamento de secado instantáneo 502 en la cabeza del nodo para aumentar la estabilidad del nodo. A continuación, corte el hilo lo suficientemente corto.
Cuando el ratón esté completamente despierto, colóquelos en una jaula de sujeción separada. Antes de la grabación electrofisiológica, utilice isoflurano para anestesiar al ratón. Retire los puntos y exponga el globo ocular.
Recorte cuidadosamente el párpado. Enjuague los ojos con soluciones de lentes de contacto y compruebe la claridad de los ojos. Sólo se puede utilizar el ratón con buen estado de los globos oculares.
Después de anestesiar el ratón, coloque el ratón sobre un marco estereotaxico. Utilice una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal durante todo el procedimiento. Aplica la pomada ocular sobre la superficie de los ojos para mantenerla húmeda.
Retire el pelo del ratón para exponer su piel. Incise un ocho milímetros multiplicado por ocho milímetros de área de la piel entre ambas orejas para exponer el cráneo y eliminar el tejido del cuero cabelludo. A continuación, retire el tejido conectivo superblando con peróxido de hidrógeno.
Taladre un agujero en el cráneo por encima del cerebelo. Fije un pequeño tornillo óseo en el agujero como referencia. Realizar una pequeña craneotomía de un milímetro de diámetro en la región binocular V1.
Retire cuidadosamente el fragmento del cráneo sin dañar el cerebro. Cubra la superficie cortical expuesta con un 2% de agarosa para evitar el secado. Fijar un electrodo de tungsteno en el marco estereotaxico.
Coloque el electrodo de tungsteno verticalmente en la región binocular V1 para asegurarse de que las células que se registran reaccionan a ambos ojos. El estímulo se separa 30 grados en un bloque aleatorio. En cada medición se presentaron un total de tres a cinco bloques.
Enmascarar un ojo con placa de plástico no transparente. Presente LCD1 a la posición en 23 centímetros de los ojos del ratón. Avance el microelectrodo lentamente por el micromaniprógrafo hidráulico de aceite.
Detener el avance de la señal de relación de ruido de señal alta cuando el electrodo está avanzado a la capa cuatro y iniciar la medición. Amplificamos las actividades de pico a un factor de 1.000 y lo filtramos de 300 a 10 kilohercios y luego lo probamos a 40 kilohercios. Luego enmascara el otro ojo y mide la respuesta del ojo contralateral.
Las señales medidas por electrodos individuales son actividades de población. Utilice software para separar picos de diferentes celdas. Primero, filtre la señal de 500 a 5.000 hercios.
Establezca dos cursores, uno para la desviación positiva y otro para los picos de desviación negativos. Configurar plantillas de pico. Establezca el área de plantillas donde muestra la mayor variación entre las diferentes clases de picos.
Utilice el análisis de componentes principales para separarlos en clústeres. Clasificar los picos de un límite mediante el algoritmo de medios K. Correlacione la orientación con la velocidad de disparo de picos y trace las curvas de ajuste de orientación para los ojos ipsilaterales y contralaterales.
A continuación, calcule el índice OD para celdas individuales que representa la respuesta contralateral e ipsilateral Asignar una puntuación OD para cada celda de acuerdo con el índice OD. Calcule el índice de sesgo contralateral de acuerdo con la fórmula. Este diagrama muestra las curvas de afinación de orientación del ojo ipsilateral y contralateral en ratón monocular privado y no privado.
Este protocolo permite una privación visual monocular exitosa y una medición de dominio ocular de un ratón privado y no privado en el período crítico. Acabamos de mostrarle cómo lograr este experimento y habíamos analizado el cambio en el dominio ocular durante la privación visual. Durante el experimento, es importante evitar la infección en el proceso de sutura e interacción durante el registro electrofisiológico.
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