La regeneración cardíaca endógena es un proceso dinámico que implica múltiples tipos de células que trabajan juntas en conjunto para montar una respuesta regenerativa robusta. El emparejamiento en el tejido regenerador a través de imágenes 3D del corazón despejado en respuesta a una lesión puede ayudar en la reconstrucción de la dinámica celular que guían esta respuesta regenerativa cardíaca. Nuestro protocolo está diseñado específicamente para rastrear células durante el desarrollo y la regeneración.
No prevemos limitaciones en la aplicación amplia de nuestras técnicas de limpieza, tinción e imagen a otros tipos de órganos. Para la oclusión de la arteria coronaria inducida por LAD, primero esterilizar el área quirúrgica de un cachorro neonatal anesthetizado de un día de edad con solución antiséptica. Haz una incisión transversal de la piel en la región torácica.
Para separar la piel del músculo, usa un par de fórceps para levantar la piel cuidadosamente mientras presionas suavemente las tijeras contra los músculos intercostales en una posición cerrada. Localice el cuarto espacio intercostal y utilice pequeños fórceps para hacer una pequeña punción superficial teniendo cuidado de evitar los órganos internos. Usando la disección contundente y los fórceps del apósito, ensancha el área entre los músculos intercostales hasta que se pueda aplicar un dedo en el lado izquierdo del abdomen mientras mantiene el espacio intercostal abierto con fórceps para guiar suavemente el corazón fuera de la cavidad torácica.
Una vez extraído el corazón, deje que el corazón descanse sobre los músculos intercostales y localice el LAD como la región del corazón con menos sangre agrupada. Para inducir el infarto de miocardio, utilice una sutura 6-0 para atar un nudo cuadrado firmemente alrededor del vaso dos veces sin cortar la arteria. El blanqueamiento en el ápice debe observarse inmediatamente.
Es importante mantenerse consistente en la colocación de la sutura a lo largo del LAD para un tamaño de infarto similar. Esto se logra mejor accediendo al corazón rápidamente mientras la sangre todavía fluye a través de las arterias. Cuando se haya colocado la sutura, deje que el corazón vuelva a caer en la cavidad torácica.
Suturar las costillas junto con un cirujano y un nudo cuadrado usando fórceps contundentes para levantar el conjunto superior de costillas mientras pasa una sutura 6-0 a través del conjunto superior e inferior de las costillas. Aplica un pequeño volumen de pegamento para la piel en la parte superior del abdomen y usa fórceps finos para colocar la piel de la parte inferior del abdomen sobre la región torácica expuesta. A continuación, coloque el cachorro en una almohadilla de calentamiento y realice la ligadura en el siguiente animal.
Cuando se hayan realizado todas las cirugías, devuelva a los cachorros calientes y móviles a la jaula de la madre. Para la claridad pasiva del tejido cardíaco cosechado, 21 días después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del final, coloque el ratón en un área quirúrgica limpia en la posición supina y asegure las extremidades con cinta adhesiva. Usando fórceps tisulares, agarre el pelaje justo debajo del proceso de xifoide y haga una incisión que abarque el ancho de la caja torácica.
Cortar junto con las porciones distales de la caja torácica y utilizar los fórceps para levantar el proceso de xifoide para exponer el diafragma. Separe el diafragma con fórceps curvos y tire del tejido cranially hasta que el corazón latiendo sea accesible. Usa los fórceps curvos para agarrar el corazón en la base y usa tijeras de iridectomía para cortar la aorta y la vena cava superior.
Coloque el corazón latiendo en un plato Petri de PBS para que el corazón bombore cualquier sangre retenida. El infarto de miocardio puede ser confirmado por una correcta colocación anatómica de la ligadura LAD. Cuando el corazón deje de latir, apriete suavemente el órgano con fórceps para expulsar la sangre residual y transferir la muestra a un vial desechable de 2,5 mililitros de vidrio que contenga dos mililitros de PBS.
Coloque el vial en una coctelera durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente cambiando la solución PBS cada 10 minutos hasta que la solución permanezca libre de sangre. Cuando el PBS esté claro, sustituya el PBS por dos mililitros de frío 4%paraformaldehído durante una incubación de cuatro horas a temperatura ambiente seguido de tres lavados de 10 minutos en la coctelera con dos mililitros de PBS fresco por lavado. Después del último lavado, llene el vial con dos mililitros de 4%acrilamida suplementados con 0.5%VA-044 solución para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, coloque el vial en un bloque de calor de 37 grados Centígrados durante tres horas. Al final de la polimerización, transfiera el corazón a un nuevo vial de cáscara de vidrio y lave el tejido cardíaco en dos mililitros de PBS fresco 10 minutos a la vez que refresque el PBS al final de cada incubación. Cuando el PBS esté claro, sustituya el tampón de lavado por dos mililitros de solución de compensación.
Incubar el espécimen a 37 grados centígrados durante varias semanas hasta que el corazón esté limpio, refrescando la solución de limpieza cada dos o tres días. Cuando el órgano esté limpio, lave la muestra con PBS en la coctelera como se ha demostrado antes de rellenar el vial con PBS fresco para una incubación de 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, reemplace el PBS por RIMS para una incubación de 24 horas a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, el tejido está completamente despejado. El tejido debe volverse transparente después de varias semanas. Para obtener imágenes del corazón del ratón postnatal despejado después de la inducción de infarto de miocardio, llene la mitad de una cámara de un portaobjetos hecho a medida con PBS y use fórceps curvos para transferir cuidadosamente el corazón despejado a la cámara.
Llene el volumen restante de la cámara con PBS. A continuación, llene la cámara con PBS hasta que la superficie del líquido forme una cúpula por encima de la parte superior de la cámara y monte la corredera de la cubierta antes de tomar imágenes del tejido mediante microscopía confocal de acuerdo con los protocolos de imagen estándar. Si la punción y la disección contundente están demasiado cerca del esternón, es posible que el corazón no pueda salir de la cavidad torácica.
Si el corazón no sale fácilmente de la cavidad, aplique presión en el abdomen izquierdo para facilitar el proceso. Pueden ocurrir complicaciones al apoyar el corazón en los músculos intercostales. Por lo tanto, es importante mantener la disección contundente a un tamaño mínimo en una orientación horizontal para permitir una visualización clara y accesibilidad del LAD.
Tenga en cuenta que una ligadura superficial tendrá menos espacio para el ajuste en la colocación final de la sutura y que la sutura atando alrededor del LAD debe realizarse con movimientos constantes controlados. Al final del paso de limpieza, todo el corazón debe ser consistentemente opaco sin decoloración en el centro. Después de unos días en solución RIMS a temperatura ambiente, el corazón debe ser completamente despejado y se puede observar cierta expansión del tejido.
Como lo observa la expresión de proteína de reportero tdTomato, los nervios cardíacos son principalmente superficiales con algunas poblaciones que residen en la capa epicardial. Es importante destacar que la confirmación de la expresión de proteínas del reportero se conserva después de someterse al protocolo de claridad como se ha demostrado. Limpiar e tomar imágenes del corazón 3D proporciona perspectiva sobre la ubicación y morfología de las poblaciones de células cardíacas.
Esto nos permite identificar nuevos aspectos en el patrón de celdas y las interacciones entre células.
