Este protocolo permite ver diferentes tipos de cultivos y observar sus interacciones con la matriz extracelular. La principal ventaja de este método es que la matriz que se obtiene se regenera mediante fibroblastos y será bastante similar a las generadas in vivo. Creemos que esta enfermedad viene irrelevante cuando se utiliza fibroblasto obtener de hornear platos.
Establecer una matriz a partir de estas células podría iluminarnos cómo puede afectar, por ejemplo, la situación persistente. Estos métodos también se pueden aplicar, por ejemplo, a estudios físicos a sobrevivientes de propiedades matririadas. Visualización de este protocolo es importante observar una técnica de pipeteo de los pasos que tienes que regentar.
Al probar estos métodos por primera vez probablemente tomará más tiempo del esperado. Nuestro consejo es prepararnos tanto como puedas con antelación y usar períodos de duración para prepararte para los próximos pasos. Comience preparando 0.2%gelatina, 1%glutaraldehído y un molar etanolamina soluciones de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Asegúrese de ejecutar cada solución a través de un filtro de 0,22 micrómetros antes de su uso. A continuación, prepare el ácido ascórbico y el tampón de la lesis. Diluir el estreptococo de pluma PBS como se describe en el manuscrito y preparar DMEM con 10%FBS.
Preparar 2%BSA desnaturalizador de calor añadiendo 2 gramos de BSA a 100 mililitros de agua estéril y calentándolo en un baño de agua hirviendo durante siete minutos. Entonces, suplemento FBS con penicilina, estreptomicina, gentamicina, y anfotericina B.Cultura telómeros recombinantes trans infectados fibroblastos humanos inmortalizados foreskin y DMEM con 10%FBS y los mantuvo a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono. Para establecer el cultivo primario de fibroblastos, corte las muestras de tejido en pequeños trozos de aproximadamente dos a tres mililitros en cubos y sembrarlas en FPS con una alta concentración de antibióticos.
Cuando aparezcan los primeros fibroblastos, sustituya el medio por el medio FBM para el mantenimiento celular. Añadir dos mililitros de 0,2% de solución de gelatina a cada pozo de una placa de seis pozos y incubarlo durante una hora durante 37 grados centígrados o durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, aspirar la gelatina y lavar cada pocólieto con dos mililitros de PBS.
Añadir dos mililitros del 1% de glutaraldehído a cada pozo e incubar la placa a temperatura ambiente durante treinta minutos que cruzará la gelatina. Aspirar el glutaraldehído y lavar los pozos en dos mililitros de PBS durante cinco minutos. Para bloquear el glutaraldehído restante, añadir dos mililitros de un molar etanolamina e incubar la placa a temperatura ambiente durante treinta minutos.
Aspirar la etanolamina y repetir los lavados con PBS. Agregue un mililitro de DMEM con 10%FPS. Si el medio se vuelve inmediatamente rosado, retírelo, lave los pozos una vez con dos mililitros de PBS y agregue otro mililitro de DMEM.
Semilla de un mililitro de suspensión de fibroblastos con 5 x 10 a las quintas células en cada pozo y cultivo de las células hasta que se alcanza el 100% de confluencia. A continuación, retire el medio y reemplácelo por DMEM con 10%FBS y 50 microgramos por mililitro de ácido ascórbico. Reemplace el medio cada dos días durante seis días.
Dos días después del último tratamiento con ácido ascórbico, retira el medio y lava los pozos con dos mililitros de PBS. Después de los lavados, agregue lentamente un mililitro de tampón de lisis precalentada e incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco a diez minutos hasta que los fibroblastos estén elliste. Sin quitar el tampón de lelisis, agregue cuidadosamente dos mililitros de PBS a cada pozo y luego aspire aproximadamente 2,5 mililitros.
Repita este proceso dos veces para un total de tres lavados. Después del lavado final, agregue dos mililitros de PBS con pen-strep. Selle la placa con película y manténgala a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres meses.
Cultivar células HUVEC y EMB-2 con 2%FBS hasta la máxima confluencia. A continuación, reemplace el medio por EBM-2 sin FBS durante ocho horas. Para preparar las matrices para la siembra celular, retírelas del refrigerador y déjelas a temperatura ambiente durante una hora.
Bloquear las matrices añadiendo dos mililitros de 2%BSA desnaturalizadora por calor y incubarlas a 37 grados centígrados durante una hora. Luego, aspirar la BSA y lavarlas con dos mililitros de PBS. Semilla 2 x 10 a las quintas células HUVEC a cada pozo de la placa recubierta con matrices derivadas de fibroblastos.
Incubar las células a 37 grados Celsius durante 16 horas y luego examinar las estructuras similares a tubos bajo un microscopio de campo brillante estándar con un aumento de 20-40x. Este protocolo se utilizó para examinar los efectos del tratamiento con PDGF en la formación de matrices derivadas de fibroblastos. Los tercer fibroblastos BGH que fueron incubados con PDGF mostraron una distribución celular más alineada en matrices que las incubadas sin PDGF.
La expresión de la proteína de colágeno 1 y fibronectina se incrementó en matrices derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF y, en consecuencia, se aumentó el grosor de la matriz. Además, los histogramas de direccionalidad demuestran que el colágeno 1 y la fibronectina muestran patrones paralelos. Cuando las células HUVEC se siembran en matrices descelularizadas derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF, desarrollaron estructuras más capilares que en ninguna condición estimulada.
Confirmar que las matrices derivadas de los fibroblastos estimulados por PDGF-BB promueven la activación de las células endoteliales. Al realizar este procedimiento, es importante preparar las soluciones con antelación y asegurarse de que las celdas estén listas antes de comenzar. Además de los estudios de células endoteliales, las matrices también se pueden sembrar con células epiteliales y se puede observar la reacción a factores externos como la condición en los medios o los fármacos citotóxicos.
La generación de matriz extracelular es crucial en el diseño de experimentos de macroambiente tumoral.
